摘　要：在不同条件下对丝状支原体山羊亚种进行培养，通过PPLO精氨酸培养基、牛心汤培养基、MEM­KM2培养基以及不同种类动物血清和同一动物不同浓度血清，从生长滴度、生长速度、培养基来源、造价各个方面的比较试验，结果显示，加100 mL/L马血清的MEM­KM2培养基更适合于丝状支原体山羊亚种的培养，它的生长滴度可达109，所需时间只为5 d，并且配置方便，价格合理。这一结果为丝状支原体山羊亚种抗原的大批量生产奠定了良好的基础。

关键词： 丝状支原体山羊亚种；生长条件；培养基

丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri)是引起山羊支原体肺炎的一种病原体，其营养要求比较苛刻，适宜生长的温度是37 ℃，pH为7.6～8.0，生长缓慢，一般需要2 d～7 d才能出现可见的生长现象。由于它没有细胞壁，所以对渗透压的变化极为敏感，要求较高湿度的培养环境，并常深入至基质内生长，导致菌落不易挑取。在液体培养基中生长后，培养液多呈极轻微的均匀浑浊。本试验从优化培养条件的角度出发，分别比较了PPLO精氨酸、牛心汤、MEM­KM2 3种培养基在不同条件下对丝状支原体山羊亚种的培养，以便得到一种最适培养基，为菌株的繁殖生长及抗原的大批量生产奠定良好的基础。

1　材料与方法

1.1　菌株与培养基

丝状支原体山羊亚种菌株由中国农业科学院兰州兽医研究所保管和供应；PPLO精氨酸培养基、牛心汤培养基、MEM­KM2培养基由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病实验室配制。

1.2　PPLO精氨酸、牛心汤、MEM­KM2培养基的比较

参照文献[1­3]，3种培养基均加200 mL/L的马血清，分别接种相同比例的丝状支原体山羊亚种菌液，37 ℃培养，进行生长速度及生长滴度观察。

1.3　MEM­KM2培养基中加不同种类动物血清的比较试验

参照文献[4­7]，MEM­KM2培养基中分别加200 mL/L的猪血清、牛血清和马血清，分别接种相同比例的丝状支原体山羊亚种菌液，37 ℃培养，进行生长速度及生长滴度观察。

1.4　MEM­KM2培养基中加不同浓度马血清的比较

参照文献[8­11]，MEM­KM2培养基中分别加50、100、150、200 mL/L马血清，分别接种相同比例的丝状支原体山羊亚种菌液，37 ℃培养，进行生长速度及生长滴度观察。

2　结果

2.1　PPLO精氨酸培养基、牛心汤、MEM­KM2培养基的比较结果

表1表明，加200 mL/L马血清MEM­KM2 培养的菌液第2天开始生长，第5天达最大浓度，生长滴度为109；牛心汤培养的菌液第3天开始生长，第6天达最大浓度，生长滴度为109；PPLO精氨酸培养的菌液第4天开始生长，第7天达最大浓度，生长滴度为108。由此可知，MEM­KM2 培养基更适合于丝状支原体山羊亚种的生长，它不仅生长滴度高、培养时间短且配置方便、价格合理。

2.2　MEM­KM2培养基中加不同种类动物血清的比较结果

结果见表2。

表1　不同种类培养基的比较

Table 1　Comparison of different kinds of culture medium

培养时间/d

Cultivated time

培养基种类　Kinds of culture medium

PPLO精氨酸

PPLO Arginine

牛心汤

Cattle heart broth

MEM­KM₂

1

－

－

－

2

－

－

＋

3

－

＋

＋＋

4

＋

＋＋

＋＋＋

5

＋＋

＋＋＋

＋＋＋＋

6

＋＋＋

＋＋＋＋

7

＋＋＋＋

生长滴度

Cultivated concertration

10⁷

10⁹

10⁹

注：①“－”表示未生长；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”分别表示生长情况依次变好。

Note：①“－”means did not grow；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”means that it got better and better.

表2　MEM­KM2加200 mL/L不同种类血清的比较

Table 2　Compare of different kinds of serum＋MEM­KM2

培养时间/d

Cultivated time

牛血清

Calf serum

猪血清

Swine serum

马血清

Horse serum

1

－

－

－

2

－

＋

＋

3

－

＋＋

＋＋

4

＋

＋＋＋

＋＋＋

5

＋＋

＋＋＋＋

＋＋＋＋

6

＋＋＋

7

＋＋＋＋

生长滴度

Cultivated concertration

10⁷

10⁹

10⁹

注：①“－”表示未生长；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”分别表示生长情况依次变好。

Note：①“－”means did not grow；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”means that it got better and better in order.

由表2结果表明，分别加200 mL/L马血清和猪血清的MEM­KM2 培养的菌液第2天均开始生长，第5天达最大浓度，生长滴度为109；加200 mL/L牛血清的MEM­KM2培养的菌液第4天开始生长，第7天达最大浓度，生长滴度为107。由此看来。猪血清和马血清更适宜于丝状支原体山羊亚种的生长，但猪血清不易获得，因此选用马血清更为合适。

2.3　MEM­KM2培养基中加不同浓度马血清的比较

结果见表3。

表3　MEM­KM2加不同浓度马血清的比较

Table 3　Compare of different concertration of serum＋MEM­KM2

培养时间/d

Cultivated time

血清浓度/%Concertration of serum

5

10

15

20

1

－

－

－

－

2

－

＋

＋

＋

3

－

＋＋

＋＋

＋＋

4

＋

＋＋＋

＋＋＋

＋＋＋

5

＋＋

＋＋＋＋

＋＋＋＋

＋＋＋＋

6

＋＋＋

7

＋＋＋＋

生长滴度

Cultivated concertration

10⁸

10⁹

10⁹

10⁹

注：①“－”表示未生长；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”分别表示生长情况依次变好。

Note：①“－”means did not grow；②“＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋”means that it got better and better in order.

由表3结果表明，加50 mL/L马血清的MEM­KM2 培养的菌液第4天开始生长，第7天达最大浓度，生长滴度为108；而加100、150、200 mL/L马血清的MEM­KM2培养的菌液其生长时间和生长滴度没有区别，都是第2天开始生长，第5天达最大浓度，生长滴度为109，因此选用马血清的浓度为10%。

3　讨论

丝状支原体山羊亚种因其营养要求比较苛刻，较难培养，这给研究工作者带来了诸多不便。常用的支原体培养基有PPLO、牛心汤、MEM­KM2等，且所需血清浓度大，成本高，培养时间长。在以往的研究中，3种培养基都用过，且都加200 mL/L的马血清或猪血清，但没有系统的研究过不同培养条件对丝状支原体山羊亚种培养的时间及滴度的影响以及大批量生产时培养基的造价问题，以便为今后该菌株的培养制定一个合理的培养基配方。在本试验中通过对3种培养基生长滴度、培养时间的比较，筛选出了MEM­KM2，从培养基的来源、价格等角度出发，通过对牛血清、猪血清、马血清的比较进一步确定了所需的血清为100 mL/L的马血清，由此筛选出丝状支原体山羊亚种的最佳培养基为加100 mL/L马血清的MEM­KM2。用它培养的菌液5 d可达最大浓度，生长滴度为109，这一结果为丝状支原体山羊亚种的培养及大批量生产奠定了良好的基础，从某种程度上解除了支原体生长速度慢且培养基配置复杂、造价高的后顾之忧。