目前我国主要以免疫灭活疫苗为主要手段控制口蹄疫的发生。但是,目前口蹄疫疫苗存在抗体合格率低,免疫持续时间短的缺点。因此如何采用有效手段提高口蹄疫疫苗的免疫效果,是当前亟待解决的一个重要问题。
笔者从中药木鳖子中提取ECMS,将ECMS和商品口蹄疫疫苗混合注射豚鼠、奶牛和猪,然后检测动物的血清抗体效价。结果表明,ECMS和口蹄疫疫苗混合后,可以使抗体效价升高,有效期延长。
一、试验材料
将中药木鳖子粉碎,用乙醇回流提取,减压浓缩,乙醚萃取以除去脂溶性成分等步骤,得到淡黄色木鳖子提取物粉末(ECMS)。
二、试验方法
(一)ECMS对口蹄疫疫苗诱导豚鼠体液免疫反应的试验
将35只雄性豚鼠(体重220±10克)随机分为7组,每组5只。每组动物肌肉注射牛口蹄疫Asial-O型双价灭活疫苗(内蒙古生物药品厂)或者口蹄疫疫苗和佐剂的混合物,每只豚鼠免疫2次,间隔时间为3周,每次注射剂量如表1所示。
表1 每只豚鼠一次注射口蹄疫疫苗和佐剂的剂量
二免后3周采血,分离血清,-20℃保存待用。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测血清口蹄疫。
(二)ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的效果试验
1.不同剂量ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的试验 将24头黑白花青年奶牛,随机分为4组,每组6头。每组动物颈部肌肉注射牛口蹄疫Asial-O型双价灭活疫苗(内蒙古生物药品厂)或者口蹄疫疫苗和佐剂的混合物,每头奶牛免疫2次,间隔时间为2个月,每次注射剂量如表2所示:
表2 每头奶牛一次注射口蹄疫疫苗和佐剂的剂量
首免前和首免后1个月,以及二免后1个月采血,分离血清,-20℃保存。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测血清口蹄疫抗体。
2. ECMS对不同剂量口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的试验 黑白花奶牛24头,随机分为3组,每组8头。每组动物颈部肌肉注射口蹄疫Asial-O型双价灭活疫苗(内蒙古生物药品厂)或者口蹄疫疫苗和佐剂的混合物,每头奶牛免疫1次,每次注射剂量如表3所示。
表3 每头奶牛一次注射口蹄疫疫苗和佐剂的剂量
首免前和首免后1个月,分离血清,-20℃保存。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测血清口蹄疫抗体。
3. ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应持续时间的试验 将黑白花奶牛12头随机分为2组,每组6头。试验组每头奶牛肌肉注射2毫升口蹄疫疫苗(牛口蹄疫O型浓缩疫苗,内蒙古生物制品厂)和1毫克ECMS混合物,对照组每头奶牛仅注射2毫升疫苗。
分别于免疫前、免疫后1个月采血,以后每2个月采血1次,连续2次,共采血4次,分离血清,-20℃保存。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测血清口蹄疫抗体。
(三)ECMS对口蹄疫疫苗诱导猪体液免疫反应的效果试验
1.ECMS对猪口蹄疫抗体水平以及免疫合格率的影响试验 将23头60日龄仔猪随机分为2组。第一组为试验组,12头,每头猪注射2毫升疫苗(猪口蹄疫O型灭活苗Ⅱ型,中牧实业股份有限公司,兰州生物药厂),免疫中混入ECMS 1毫克;第二组为对照组,11头,仅注射2毫升疫苗。分别于免疫前和免疫后3周采血,分离血清,-20℃保存。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测血清口蹄疫抗体。
2.对不同母源抗体水平仔猪免疫口蹄疫疫苗的效果 将48头60日龄仔猪分为高母源抗体(≥1:128,25头)和低母源抗体(<1:128,23头)两大类。各类再随机分成1,2,3,4四组,各组仔猪免疫时将疫苗和ECMS混合。各组每头份ECMS的含量分别是1毫克,2毫克,3毫克,4毫克和0毫克(对照组)。分别于免疫前和免疫后3周采血,分离血清,-20℃保存。血清在检测前经56℃水浴30分钟。按照说明书,采用正向间接血凝试验试剂(中国农业科学院兰州兽药研究所生产)检测血清口蹄疫抗体。
三、统计分析
运用pass软件One-Way ANOVE模式进行数据分析,所有组用Turkey检验法进行组间比较,p<0.05为差异显著。
四、试验结果
(一)ECMS对口蹄疫疫苗诱导豚鼠体液免疫反应的效果试验
口蹄疫疫苗和ECMS或者和QA混合免疫动物比用口蹄疫疫苗单独免疫可诱导更高的IHA效价,其中ECMS 100微克和QA 100微克组的IHA效价显著高于对照组(p<0.05)。
(二)ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的效果试验
1.不同剂量ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的影响 给奶牛免疫2次口蹄疫疫苗以后,各组奶牛的平均抗体水平显著上升。其中注射含ECMS疫苗的奶牛平均抗体增幅高于对照组,以2毫克剂量组的平均抗体水平最高,和对照组比较有显著差异(p<0.05)。
2.ECMS对不同剂量口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的效果试验 奶牛免疫口蹄疫疫苗以后,各组的平均抗体水平显著上升。抗体平均水平和免疫合格率以常规疫苗剂量和ECMS混合组最高,常规疫苗剂量组和1/2疫苗剂量 ECMS组差异不大,各组之间无显著性差异(p>0.05)。
表4 ECMS对不同剂量口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应的影响
*牛血清IHA效价1:256(28)为合格
3.ECMS对口蹄疫疫苗诱导奶牛体液免疫反应持续时间的影响 如图3所示,奶牛注射口蹄疫疫苗以后1个月检测,每头牛的抗体水平平均达到合格,免疫以后3个月和5个月检测,第2组的抗体水平趋于下降。其中对照组的抗体水平下降较迅速,免疫合格率只有33%和50%;试验组的抗体水平下降速度较缓,显著高于对照组(p<0.05),抗体合格率达到100%。
(三)ECMS对口蹄疫疫苗诱导猪体液免疫反应的试验
1. ECMS提高猪抗体水平以及免疫合格率试验 ECMS组IHA效价的升高幅度比对照组大,抗体合格率也由免疫前的33.3%提高到50%。但对照组的抗体合格率免疫前后不变,两组无统计学差异。
表5 ECMS对口蹄疫疫苗诱导猪体液免疫反应的影响
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