摘　要：本试验通过IBDV标准毒株（IBDV BC 6／85 F4）和IBDV河北分离株分别接种于SPF鸡胚以及鸡胚成纤维细胞（CEF）。吸取接毒后2～5天内死亡鸡胚的尿囊液和绒毛尿囊膜，及细胞病变达到80%时的细胞培养液。经反复冻融，利用氯仿沉淀病毒，聚乙二醇6000浓缩病毒，蔗糖梯密度低温超速离心和葡聚糖G－200凝胶柱过滤等方法纯化病毒。经分光光度计检测，病毒的蛋白含量为1.377毫克/毫升， 琼脂扩散试验证实被检抗原为IBDV。
关键词：鸡传染性法氏囊病毒；鸡胚；鸡胚成纤维细胞；增殖；纯化

目前，鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) 变异株、超强毒株及血清亚型的不断涌现，增加了鸡传染性法氏囊病(IBD) 临床确诊及防治的难度，因此建立快速、准确、简便的IBD 诊断技术势在必行。各种新型检测方法如RT-PCR、双夹心ELISA、斑点ELISA、斑点免疫金银染色法等都需要对IBDV进行增殖和纯化鉴定。本试验从抗原角度出发，研究IBDV增殖和纯化的方法，为IBDV分子水平的检测提供基础资料。
1 材料与方法
1.1材料
IBDV标准毒株（IBDV BC 6／85 F4）购自中国农科院兽药监察所，IBDV河北分离株 由河北农业大学微生物教研室分离并鉴定。非免疫蛋（SPF）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，细胞培养及病毒纯化试剂均购自海泰克生物技术有限公司。
1.2 CEF的培养和鸡胚的准备
取9～11日龄非免疫鸡胚，依照杜平的方法制备鸡胚成纤维细胞（CEF）。
取10～12日龄SPF鸡胚，选择血管较少的部位，用锯条在卵壳上锯一小三角，用碘酊和酒精消毒，在气室中央也钻一个孔，轻挑壳膜，滴加生理盐水于刺破处，用橡皮乳头吸气，造成气室内负压，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，供接病毒液。
1.3 IBDV的增殖
鸡胚接种：将法氏囊病毒BC 6/85标准株用灭菌盐水稀释后，滴于绒毛尿囊膜上，0.2 毫升/胚，用盖玻片盖于卵窗上，用石蜡密封。鸡胚接种后，横卧于温箱中，禁止翻动，保持卵窗向上。用检卵灯每天检卵一次，24小时内死亡者废弃。收取2～5天内死亡的鸡胚，置于4℃冰箱，然后无菌采取尿囊液和绒毛尿囊膜，放入无菌的青瓶内，置-20℃冰箱等待进一步纯化。
CEF接种：CEF长成单层后，弃去生长液，用Hank's液洗三次除去未贴壁、衰老死亡细胞及细胞表面的血清，接种IBDV BC 6/85标准株，l毫升／10毫升，37℃温箱吸附2 小时。然后倾去剩余病毒液，加维持液10 毫升，于37℃、5％CO2的培养箱中培养。48～72 小时左右当CPE达85％时收毒，并标记为IBDV标F1代毒，置-20℃反复冻融3次后，接种于长成单层的CEF细胞上，48～72 小时收毒，标记为IBDV标F2代毒，以后同上继续传代接毒到所需病毒量。
1.4 IBDV的纯化
按Marquardt等和Tsukamoto等方法适当改进。
鸡胚毒的纯化：将收集到的鸡胚尿囊液和绒毛尿囊膜反覆冻融3次，然后倒入乳钵中加入等量的生理盐水和一些玻璃砂用乳钵研磨至泥状，用铜网过滤，4000 转／分钟，离心30 分钟，取上清液。按病毒液︰氯仿＝3︰1的量加入氯仿，4℃放置2小时，然后12000 转／分钟，离心30分钟，取上清液加入到透析袋里，用聚乙二醇6000包埋，浓缩至原体积的1／10，加入少量的TNE（ 0.01M Tris，0.1M NaCI，0.001IM EDTA，pH7.4）缓冲液混匀袋内病毒，吸取透析袋内的液体，再用氯仿处理2次，吸取上清备用。取氯仿处理过的病毒液经15000 转/ 分钟，离心30 分钟，取上清经38000转/ 分钟，4℃进行30％～60％蔗糖不连续密度梯度离心2.5 小时，收集病毒层，并用透析袋透析除去蔗糖。
细胞毒的纯化：取反覆冻融三次各代次合并后的细胞毒，用氯仿处理沉淀一次。取用氯仿处理过的法氏囊细胞毒上清液，加8％ PEG6000，4％ NaCl，置4℃搅拌过夜，第二天以12000 转/分钟离心30 分钟，将病毒沉淀溶于原病毒液体积的1／10的TNE缓冲液中，经Sephadex G－200柱凝胶过滤法纯化病毒；取少量测OD值后小量分装，置-80℃保存备用。
1.5 IBDV病毒抗原的鉴定
病毒含量的测定：取提纯后的病毒测其OD280纳米和OD260纳米处的光密度值，按刘玉斌的方法计算蛋白含量。
病毒的琼扩试验：制备1%的琼脂平板（其中含8% NaCl，0.05%苯酚，pH 6.8），按常规打梅花形孔，中心孔加入IBDV高免阳性鸡血清，周围孔依次加入纯化的IBDV抗原，同时设阴性对照（正常鸡胚尿囊液和鸡胚成纤维细胞）和阳性对照（法氏囊琼扩抗原）。将琼脂板置湿盒内，37℃培养24～48小时，观察沉淀线。
2 结果
2.1病毒含量的测定
用756型分光光度计分别检测经30倍稀释后的IBDV标准毒和河北分离株的提纯病毒液，标准毒株提纯后病毒液的 OD280纳米处的光密度值为0.190，OD260纳米处的光密度值为0.254，病毒的蛋白含量为0.190×0.56×30＝3.192毫克/毫升；河北分离株的提纯后病毒液的OD280纳米处的光密度值为0.102，OD260纳米处的光密度值为0.154，病毒的蛋白含量为0.102×0.45×30＝1.377毫克/毫升。
2.2 琼脂扩散试验检测IBDV
经24～48小时 37℃扩散，可见抗原孔和标准阳性血清孔之间出现一条乳白色清晰的封闭沉淀线，表明被检抗原为IBDV。
3 讨论
3.1 IBDV的增殖
IBDV通常使用鸡胚或细胞增殖。我们在实验中发现鸡胚绒毛尿囊膜比尿囊腔更为敏感，Winterfield 报道除尿囊膜和尿囊腔外，从胚体也可获得大量的病毒。但含有胚体的匀浆内含有大量的杂物，因此在病毒的纯化上会有很大的难度。据陈明勇等利用鸡胚法氏囊原代细胞培养IBDV获得了高滴度的病毒液，汪培林等用Vero细胞培养增殖法氏囊病毒，速度快且收获量也大。本试验采用鸡胚原代细胞增殖IBDV同样也获得了较高含量的病毒。IBDV接种于CEF单层后，前几代往往不到48小时就都脱落了，但随着传代次数的增加病变和脱落的时间会相对稳定在48～72小时。这是因为前几代时病毒还不适应细胞，等适应后会逐渐稳定下来。
实验中发现当维持液中含有1％的血清时也会对病毒的增殖产生影响，这是由于IBDV对血清敏感。因此，在接毒时一定要用Hank's液多洗几遍细胞面，将残余的血清都洗干净，在维持液中不加血清，从而才能获得高滴度的病毒液。此外，接毒后病毒在细胞上吸附的时间也很重要，吸附时间短，病毒和细胞没有充分的结合，因而得到的病毒含量也会降低。通过试验我们认为接毒后吸附2小时时，病毒才能充分与细胞相结合，这样获得的病毒液的病毒含量较高。
3.2 IBDV的纯化
在建立一种有效的检测方法时获得较纯的病毒是其前提。在对组织毒进行浓缩和提纯时，首先要去除杂蛋白，在以往的文献的报道中大多采用氟里昂来沉淀杂蛋白。本试验中采用了氯仿沉淀杂蛋白，虽然反应较激烈，但也得到了很好的效果。在病毒的浓缩的过程中，王成明等报道了利用透析带从感染IBDV法氏囊组织匀浆上清中浓缩病毒的方法，张绍学等报道了利用PEG 6000从细胞培养物中浓缩病毒的方法。我们在试验的过程中分别尝试了两种方法，由于鸡胚毒自身的杂质过多，采用透析更为妥当，而细胞毒用PEG 6000浓缩，病毒回收率可达到80%，由此可见，在对不同来源的病毒进行浓缩时应选一合适的方法。
在病毒的纯化过程中，常规方法是使用超速离心机进行CsCl密度梯度离心。由于实验目的不同，可以采取不同的方法提纯病毒。本试验鸡胚毒的纯化采取了蔗糖垫梯密度超速离心，细胞毒使用了葡聚糖G-200凝胶过滤的方法。超速离心在30％和60％的蔗糖垫中间出现了一条薄的乳白色带，经SDS-PAGE电泳后表明此方法获得的病毒蛋白较纯。与传统的氯化铯梯密度离心相比，此方法更为经济和实用。使用SephadexG-200凝胶层析法纯化病毒，其纯度可达到免疫纯水平。G-200层析柱的分离范围在0.4kDa～250kDa，IBDV的分子量在28～94kDa左右，在其分离范围之内，且G-200适宜于分离大分子物质，IBDV大小为55～60纳米，颗粒较为均一，过凝胶柱时病毒粒子不进入网眼内，洗脱较慢，从而达到分离纯化的目的。试验的过程中，我们使用的层吸柱长度为50厘米，收集的病毒洗脱高峰经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现仍有少量牛血清蛋白的存在，推测其原因可能是由于层析柱不够长未能进行充分分离，其分离病毒的效果有待于进一步探讨。
4 结论
通过鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖IBDV，经反复冻融、氯仿处理后，蔗糖垫离心和PEG 6000浓缩病毒，葡聚糖G-200凝胶过滤等方法获得了纯度较高的IBDV。