摘　要：探讨阿维菌素微囊的安全性，为临床研究提供试验依据，以大鼠作为研究对象，采用腹腔注射法进行了急性和亚慢性毒性试验。结果表明，阿维菌素微囊的半数致死量(LD50 )为31.73 mg/kg，与普通注射剂相比大了113%；再以1/10、1/20 和1/50 LD50(高、中、低剂量组)给大鼠用药， 连续腹腔注射21 d， 给药部位未见异常，低剂量组血液生理生化指标正常，各实质性器官细胞未见组织学病变；高、中剂量组出现体重增长缓慢、行动迟缓等异常情况，停药2周后恢复正常。说明阿维菌素经微囊化后毒性明显降低，该制剂基本安全，可用于临床研究。

关键词：阿维菌素；微囊；毒性；大鼠

阿维菌素是一种大环内酯类抗生素，具有广谱的杀线虫和外寄生虫作用， 已广泛用于家畜寄生虫病的治疗，其剂型有预混剂、片剂、糊剂、口服液、注射剂和浇泼剂，这些制剂可以不同程度的满足不同种类动物和不同饲养方式下的用药需求。但采用这些普通制剂，费时费工且效果较差，治疗不彻底，容易复发，达不到长效预防的目的，而且所需用药量大，用药频繁，成本高，对动物造成一系列不良反应。表现在抗虫株的出现，使其产生抗药性，重复感染，不易治疗；持续高剂量的使用能导致动物中毒，使动物的生产性能下降；动物体内阿维菌素的残留，特别是在肉、乳、蛋中的残留，对人体造成一系列的危害。因此，对阿维菌素制剂研究与开发是近年来新兽药研究的一个热点内容，开发长效控释剂也是畜牧业发展的客观需求[1]。而微囊是以天然或人工合成的高分子材料将药物包裹其中，具有控制释放、靶向给药、降低毒副作用等特点，其应用范围越来越广。本试验采用复凝聚法制备了阿维菌素微囊，通过对其毒性试验，旨在评价其安全性，为临床研究提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

阿维菌素微囊(采用复凝聚法自制，平均载药率为13.14%，平均包封率为66.35%)，阿维菌素注射液(1%阿维菌素无菌注射液，齐鲁动物保健品厂，批号为20030225)，血红蛋白转化液、白蛋白、总蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、尿素氮、胆固醇等试剂盒，肝素钠；仪器有MD­100半自动化分析仪、血细胞分析仪，AEU­210分析天平，XS­213JNOEG双目显微镜台式离心机；Wistar大鼠180只，购于湖南农业大学动物医学院动物饲养室，体重为180 g～220 g，雌雄各半。

1.2　方法

1.2.1　急性毒性试验　经预试初步确定最大致死剂量和最小致死剂量后，取健康大鼠100只，体重为180 g～220 g，雌雄各半，随机分两组，试验组50只，分为5个亚组(n＝10)，分别给予阿维菌素微囊20.00、24.00、28.80、34.56、41.47 mg/kg，均采用等容量不等浓度给药，按10 mL/kg体重腹腔注射；对照组50只，分为5个亚组(n＝10)，分别腹腔注射阿维菌素注射液8.00、9.60、14.40、17.28、20.74 mg/kg，给药方法与试验组相同。连续观察7 d，观察大鼠的精神状况、食欲状况、行为、体温、死亡情况以及粪便是否形成等。记录各剂量组大鼠的死亡情况，并将死亡大鼠剖检观察其脏器病理变化，采用改良寇氏法计算LD 。

1.2.2　亚慢性毒性试验　大鼠80只，雌雄各半，随机分为4组，每组20只，第1组为生理盐水对照组，第2、3、4组为试验组，依次按1/10、1/20、1/50 LD50每天同一时间腹腔注射阿维菌素徽囊(10 mL/kg)，连续21 d，再饲养2周作为恢复期，各组均采用相同的饲养管理方式。检查项目有：①外观体征和行为活动、食量、粪便性状及体重变化；②血液学及生化指标；③病理剖检和病理组织学检查。在最后一次给药后12 h进行一批放血处死(每组10只，雌雄各半)，取血样，进行血液生理生化指标检测和病理组织学观察[6­11]。

2　结果

2.1　急性毒性试验

高剂量组动物先出现中毒症状，表现为被毛蓬松，上眼睑下垂，共济失调，抽搐，精神抑郁，随后伏卧不起，直至死亡。剖检死亡大鼠各脏器，肝脏少见有淤血、坏死点，肠系膜充血，其他被检脏器如心、脾、肺和肾未见异常。病理组织学检查发现肝脏中央静脉有轻微充血，而肝索和静脉窦正常，肝细胞无异常变化。心脏、肾脏和肺脏等均未见明显病理变化。从表1和表2可以看出，阿维菌素注射液经腹腔给药，其LD50为14.69 mg/kg±1.37 mg/kg，阿维菌素微囊的LD50为31.73 mg/kg±3.046 mg/kg，与原药相比增大了113%。

表1　阿维菌素注射液经大鼠腹腔给药的LD50

Table 1　LD50 of avermectin injection via ip in rats

剂量/(mg·kg^－1)

Dose

动物数/只

Number of rats

死亡数/只

Number of died rats

死亡率/%

Death rate

存活率/%

Survive rate

LD₅₀(95%置信限)

/(mg·kg^－1)

Confidence limits

ofLD₅₀(95%)

8.00

10

0

0

100

14.69±1.37

9.60

10

2

20

80

14.40

10

5

50

50

17.28

10

7

70

30

20.74

10

10

100

0

表2　阿维菌素微囊经大鼠腹腔给药的LD50

Table 2　LD50 of avermectin microcapsule via ip in rats

剂量/(mg·kg^－1)

Dose

动物数/只

Number of rats

死亡数/只

Number of died rats

死亡率/%

Death rate

存活率/%

Survive rate

LD₅₀(95%置信限)

/(mg·kg^－1)

Confidence limits

of LD₅₀(95%)

20.00

10

0

0

100

31.73±3.046

24.00

10

1

10

90

28.80

10

3

30

70

34.56

10

7

70

30

41.47

10

9

90

10

2.2　亚慢性毒性试验

2.2.1　阿维菌素微囊对大鼠体重的影响　对照组与低剂量组大鼠行为均正常，高、中剂量组给药15 d后出现食量减少，竖毛，行动迟缓等现象，给药21 d，停药2周后，以上症状明显恢复，动物皮毛有光泽，行动自如，食量和粪便均正常。分别于给药前1 d，给药后第7、14、21天和2周恢复期后对试验大鼠称重，计算平均体重(表3)。

表3　大鼠的体重变化

Table 3　Weight changes in rats

时间/d

Time

生理盐水组

NS group

低剂量组

Low dose group

中剂量组

Middle dose group

高剂量组

High dose group

0

199.12±22.32

195.34±20.31

200.36±18.41

196.54±19.34

7

215.42±25.65

206.49±28.31

210.46±20.87

205.25±23.67

14

232.33±24.52

227.89±23.18

220.49±20.34

214.32±25.48

21

243.23±25.04

238.66±26.31

228.46±25.83

220.49±28.03

35

260.23±28.01

255.66±27.59

243.46±30.42

235.49±33.27

注：试验3个剂量组大鼠体重变化与生理盐水组比较，差异不显著(P>0.05)。

Note：Weight changes in rats of 3 dosage groups have no significant difference compared with that in NS group(P>0.05).

由表3可看出，各剂量组实验动物的体重均呈稳定的上升趋势。高、中剂量组在给药后14 d，增重速度减慢，给药21 d后，体重增长明显减慢但差异不显著(P>0.05)，停药2周后，体重有明显的恢复增长趋势。

2.2.2　大鼠血液生理生化指标的检测　大鼠血液生理生化指标见表4和表5，结果表明， 大鼠腹腔注射阿维菌素微囊后， 其肝功能指标和血液学指标，除尿素氮和白细胞外，均在正常生理生化指标范围内，与对照组相比， 无显著差异(P>0.05)。

表4　21 d的大鼠血液生理生化指标

Table 4　Blood physiological and biochemical indexes in rats 21 d after experiment

时间/d

Time

生理盐水组

NS group

低剂量组

Low dose group

中剂量组

Middle dose group

高剂量组

High dose group

总蛋白/(g·L^－1)　TP

70.14±3.31

74.28±4.12

76.03±4.08

67.24±4.32

白蛋白/(g·L^－1)　ALB

28.33±2.18

30.54±2.74

34.28±3.44

26.72±3.38

碱性磷酸酶/(U·L^－1)　ALP

60.27±3.48

58.42±4.58

69.27±4.21

49.42±3.21

谷丙转氨酶/(U·L^－1)　ALT

45.95±2.74

50.12±3.18

42.38±4.12

42.32±3.08

尿素氮/(g·L^－1)　BUN

0.45±0.02

0.50±0.03^b

0.40±0.02

0.32±0.03^a

胆固醇/(g·L^－1)　CHOL

1.35±0.12

1.39±0.15

1.20±0.29

1.02±0.28

红细胞/(10¹²个·L^－1)　RBC

7.93±0.24

8.25±0.72

7.38±1.09

7.23±1.59

白细胞/(10⁹个·L^－1)　WBC

8.24±1.31

10.07±1.24^b*

6.24±1.23^a*

6.01±1.28^a*

血红蛋白/(g·L^－1)　HGB

154.02±8.24

149.25±9.25

130.04±9.42

125.32±10.41

注：同一行标注字母不同表示差异显著(P<0.05) ，“*”表示差异极显著(P<0.01) 。

Note：The means in the same line with different small letters differ significantly (P<0.05)； the means in the same line with different small letters with * differ very significantly(P<0.01).

表5　恢复2周的大鼠血液生理生化指标

Table 5　Blood physiological and biochemical indexes in rats 2w after recovery

时间/d

Time

生理盐水组

NS group

低剂量组

Low dose group

中剂量组

Middle dose group

高剂量组

High dose group

总蛋白/(g·L^－1)　TP

72.24±3.48

73.18±5.21

74.32±5.12

70.23±5.23

白蛋白/(g·L^－1)　ALB

29.48±3.21

31.24±3.42

30.18±4.23

30.27±3.92

碱性磷酸酶/(U·L^－1)　ALP

62.73±4.21

59.28±5.41

64.34±5.12

54.28±3.42

谷丙转氨酶/(U·L^－1)　ALT

48.32±3.54

51.43±3.42

45.32±4.32

46.29±4.12

尿素氮/(g·L^－1)　BUN

0.43±0.02

0.53±0.04

0.45±0.03

0.41±0.04

胆固醇/(g ·L^－1)　CHOL

1.36±0.18

1.43±0.18

1.31±0.31

1.20±0.30

红细胞/(10¹²个·L^－1)　RBC

8.04±0.83

8.32±0.93

7.81±1.21

7.92±1.42

白细胞/(10⁹个·L^－1)　WBC

8.45±1.24

9.93±1.43^b

7.38±1.52^a

7.08±1.01^a

血红蛋白/(g·L^－1)　HGB

158.29±9.48

153.52±10.21

142.03±10.21

138.04±10.28

注：同一行标注字母不同表示差异显著(P<0.05)。

Note：The means in the same line with different small letters differ significantly(P<0.05).

2.2.3　大鼠病理学检查　试验结束后处死大鼠， 取心、肝、脾、肾、肠进行大体解剖学检查， 试验组和对照组大鼠以上各脏器均色泽正常， 质地柔软， 表面无坏死、硬化、肿大、萎缩等异常现象。剖开以上脏器未发现出血、渗出、炎症等病理现象， 测定各脏器的重量和体积， 试验组与对照组相比， 亦无显著差异(P>0.05)。以上脏器组织固定， 切片、HE 染色后进行组织学检查， 均未发现实质性病变及有意义的病理变化。

3　讨论

采用改良寇氏法计算LD50及有关参数，计算简便。阿维菌素经腹腔注射后，大鼠的LD50为14.69 mg/kg±1.37 mg/kg，与扈洪波等[7]的阿维菌素急性试验结果(LD50 10.44 mg/kg) 相比， 剂量略偏高，可能与动物和其他试验条件有关。微囊化的目的是提高治疗部位的药物浓度，降低不良反应，减少药物用量，提高药物的安全性和有效性[9]。阿维菌素经微囊化后，其LD50为31.73 mg/kg，比普通注射剂大了113%，毒性明显降低。亚慢性毒性试验中，低剂量组和生理盐水组的各项指标均正常， 中、高剂量组体重增长缓慢， 但经停药2 周后恢复正常。腹腔注射给药所产生的毒性经一定时间可恢复正常，可能系腹腔内的微粒异物反应引起的腹膜间皮增生[3]。高、中、低剂量组血液生理生化指标正常，健康状况良好，对其内脏器官进行组织学检查，均无形态学变化和实质性病变，说明阿维菌素微囊对动物体无蓄积毒性作用，对动物的组织和器官无损害作用，表明该制剂基本安全，可用于临床研究。