摘　要：通过子宫内灌注盐酸环丙沙星，采用内标法以反相高效液相色谱法测定了4头患子宫内膜炎的奶牛乳汁中盐酸环丙沙星的药物浓度。研究表明，在奶牛给药后0 h～24 h，血药浓度大于乳药浓度，在24 h后，乳药浓度大于血药浓度。在48 h内盐酸环丙沙星的乳药浓度值均高于MIC值，所以仍具有抑菌作用，这对乳房炎的治疗具有重要意义。

关键词：盐酸环丙沙星；奶牛；子宫内膜炎；乳腺排泄

盐酸环丙沙星为第三代喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、吸收完全、副作用小等特点。国内已广泛用于临床，抗感染效果良好[1]。国内外对环丙沙星在动物体内的排泄研究已有很多[2­6]。但在患子宫内膜炎奶牛的应用及其乳腺排泄情况尚未见有报道。本文旨在探讨该药在患子宫内膜炎奶牛乳腺排泄的情况，为患子宫内膜炎奶牛子宫用药后乳腺排泄情况提供参考资料，同时为该药在患乳房炎或子宫内膜炎并发乳房炎时的用药提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　仪器

美国Waters 510高效液相色谱仪，Waters 510型输液泵，474型可调波长荧光检测器，U6K型进样阀，AST型数据处理仪。

1.2　药品和试剂

盐酸环丙沙星标准品，含量99.06%。二氟沙星标准品，含量99.56%。乙腈，色谱纯，四丁基溴化铵，甲醇，85%磷酸为分析纯，双蒸水为兰州生物所细胞培养室提供。

1.3　盐酸环丙沙星标准液

配制0.2 mg/mL的盐酸环丙沙星标准液，0.5 mg/mL的二氟沙星标准液。临用前再按要求用双蒸水配成系列标准浓度。

1.4　试验用动物

处于发情期的4头患子宫内膜炎的奶牛，由兰州市段家滩奶牛场提供。在试验前均未给任何药物。

1.5　动物给药及采样

给药前4头奶牛用改装的输精器分别子宫灌注250 mL的生理盐水冲洗子宫3次，再灌注25 mg/mL的盐酸环丙沙星100 mL。给药前采一定量的空白乳样。分别于给药后8、24、32、48、56、60、72、80、96、104、120、128、144 h采乳样。每次采乳量5 mL于离心管中，加入5 mL的乳蛋白沉淀剂(甲醇∶850 mg/L，磷酸为6∶1)，用旋涡混合器摇匀。3 000 r/min离心10 min。弃上层脂肪层，吸取上清液3 mL；给药后分别于8 h和24 h采血，除去蛋白，加内标处理，置－4 ℃冰箱保存至测定。

1.6　样品预处理

取离心管加入1 mL浓度为0.5 mg/L的二氟沙星标准液，置于50 ℃的水浴锅中用氮气吹干。将乳样于室温中摇匀，取乳清1 mL加入该试管中。经针头式过滤器过滤。吸取20 μL样品，进行HPLC分析。

取离心管，加入1 mL浓度为0.5 mg/L的二氟沙星标准液，用氮气吹干。血浆于室温中自然解冻，摇匀后取1 mL加入该试管中，再加入2 mL甲醇，用旋涡混合器混合2 min。以3 000 r/min离心10 min。取上清液1 mL置入另一试管中，氮气吹干。加入200 μL流动相，混溶后，经针头式过滤器过滤。吸取20 μL样品，进行HPLC分析。

1.7　检测方法

样品中盐酸环丙沙星采用HPLC内标法，内标物为二氟沙星。固定相：色谱柱ODS­1，测定流动相，0.015 mol/L四丁基溴化铵溶液乙腈(92∶8)，以85%的磷酸调pH为3.0。检测器为WATERS荧光检测器。柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。保留时间：盐酸环丙沙星为9.48 min～11.25 min；二氟沙星为19.79 min～20.73 min。检测波长：λex为278 nm， λem为465 nm。

1.8　数据处理

测定乳汁中盐酸环丙沙星浓度(Yt)，计算以下各值：△Dt为采样间隔内排泄的药物量，△Dt＝ Yt×采样间隔内乳汁的质量[7­8]。

2　结果

2.1　乳汁标准曲线和线性范围

空白乳汁中添加不同浓度的盐酸环丙沙星后，所得的标准曲线的回归方程的数字见表1。在5支离心管中各加入1 mL浓度为0.5 mg/L的二氟沙星标准液和1 mL盐酸环丙沙星系列浓度标准液(0.001 mg/L～0.1 mg/L)。标准曲线在0.005 mg/L～0.1 mg/L的范围内线性良好，其回归曲线为Y＝2.000 2 X－0.017 3， r2＝0.999 4。最低检测限为0.005 mg/L。

表1　乳汁中盐酸环丙沙星和二氟沙星标准曲线系列浓度

Table 1　The concentrations of standard curve of difloxacin and ciprofloxacin in milk

管号

Tubes

1

2

3

4

5

盐酸环丙沙星浓度/(mg·L^－1)

Ciprofloxacin concentration

0.1

0.05

0.02

0.01

0.005

盐酸环丙沙星量/mL

Ciprofloxacin volume

1

1

1

1

1

二氟沙星浓度/(mg·L^－1)

Difloxacin concentration

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

二氟沙星量/mL

Difloxacin volume

1

1

1

1

1

空白乳清/mL

Blank whey

1

1

1

1

1

制得的浓度比

Concentration ratio

0.2

0.1

0.04

0.02

0.01

2.2　乳汁中药物回收率和变异系数

将一定量的盐酸环丙沙星和二氟沙星标准液加入奶牛空白乳汁中，制得不同浓度的盐酸环丙沙星。测得盐酸环丙沙星在乳样中的平均回收率为100.34%±1.67%，盐酸环丙沙星测定全程的批内变异系数为1.96%，批间变异系数为3.18%。

2.3　血清标准曲线和线性范围

空白血样中添加不同浓度的盐酸环丙沙星后，所得的标准曲线的回归方程数字见表2。在7支离心管中各加入1 mL浓度为0.5 mg/L的二氟沙星标准液和1 mL盐酸环丙沙星系列浓度标准液。盐酸环丙沙星在血样中的平均回收率为(102.1±6.0)%，标准曲线在0.01 mg/L～1 mg/L的范围内线性良好，其回归曲线为Y＝0.268 9X＋0.011 6。相关系数r2＝0.997 5。盐酸环丙沙星测定全程的批内变异系数为1.66%，批间变异系数为2.67%。

2.4　盐酸环丙沙星在子宫内膜炎的奶牛乳汁中的药物浓度

4头患子宫内膜炎的奶牛按2.5 g/头剂量子宫内灌注盐酸环丙沙星，乳中盐酸环丙沙星药物浓度(mg/L)及乳汁的排泄量见表3。

表2　血浆中盐酸环丙沙星和二氟沙星标准曲线系列浓度

Table 1　The concentrations of standard curve of difloxacin and ciprofloxacin in plasma

管号

Tubes

1

2

3

4

5

6

7

盐酸环丙沙星浓度/(mg·L^－1)

Ciprofloxacin concentration

1

0.5

0.2

0.1

0.05

0.02

0.01

盐酸环丙沙星量/mL

Ciprofloxacin volume

1

1

1

1

1

1

1

二氟沙星浓度/(mg·L^－1)

Difloxacin concentration

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

二氟沙星量/mL

Difloxacin volume

1

1

1

1

1

1

1

空白血浆/mL

Blank plasma

1

1

1

1

1

1

1

制得的浓度比

Concentration ratio

2

1

0.4

0.2

0.1

0.04

0.02

表3　乳汁中药物排出情况

Table 3　The condition of ciprofloxacin in milk

采样时间/h

Sampling time

盐酸环丙沙星

血药浓度/(mg·L^－1)

Ciprofloxacin concentration

in blood

盐酸环丙沙

星乳药浓度/(mg·L^－1)

Ciprofloxacin concentration

in milk

乳汁体积/L

Milk volume

乳汁中盐酸环

丙沙星排出量/mg

Ciprofloxacin quantity

in milk

8

0.052 493±0.004 2

0.021 523±0.006 6

10.56±0.48

0.227 177

24

0.023 52±0.003 7

0.013 154±0.006 7

19.78±0.56

0.260 186

32

－

0.018 671±0.009 3

11.90±1.37

0.222 185

48

－

0.0131 44±0.006 2

20.28±0.48

0.266 56

56

－

0.008 49±0.004 3

13.56±0.41

0.115 124

60

－

0.003 25±0.001 5

19.32±0.90

0.062 79

3　讨论

单剂量子宫内灌注盐酸环丙沙星后，乳汁中药物浓度在8 h挤奶时最高，达0.021 523 mg/L±0.006 6 mg/L。以后呈下降趋势，在32 h又有所上升，然后又下降，到60 h到达0.003 25 mg/L±0.001 5 mg/L。

刘涤洁等[9]发现奶山羊乳中的药物浓度高于同期血中药物浓度， 且乳中环丙沙星浓度高于恩诺沙星浓度并维持更长的时间，氟喹诺酮类药物是一种亲水的两性化合物， 在血浆pH 7.4时，易通过血­乳屏障。在奶山羊乳汁pH 6.7 时，几乎完全解离，故药物在乳中积聚而有较高浓度。而韩建春等[10]在奶牛上的研究结果不尽相同，发现在奶牛给药后0 h～24 h，血药浓度大于乳药浓度，在24 h后，乳药浓度大于血药浓度，这与本研究的结果一致，这可能是药物的种属差异造成的。

环丙沙星最小杀菌浓度(MBC)和最小抑菌浓度(MIC)相近，而且杀菌作用具有浓度依赖性。环丙沙星对各种G－菌具有显著的抑菌活性。其对大肠埃希菌MIC为0.002 mg/L～0.025 mg/L，沙门菌为0.2 mg/L～0.05 mg/L，绿脓杆菌为0.06 mg/L～0.25 mg/L[11]。乳汁中的药物在48 h时其浓度为0.013 144 mg/L±0.006 2 mg/L，乳汁中存在的药物，在体内可以抑制大肠埃希菌、绿脓杆菌等微生物，这对乳房炎的治疗提供了可靠的依据。同时由于其较低的浓度，可能造成部分细菌的耐药性。