方剂是在中（兽）医理论指导下，辨证论治的基础上，根据动物病情需要选择适当的（两位或多味）中药，酌定用量，按照一定的组成原则，配伍组合而成。药物决定方剂的功效，方剂中药味的增加或减少以及用量，可导致方剂配伍关系和功效变化。在中药方剂及新药研究中，虽可根据中兽医理论和临床经验选择药物和组方，但中药方剂多为复方且药物剂量不一，即存在多因素多水平特点[1]，为中兽药作用机理研究、中药现代化和新药开发及其产业化带来很多困难。正交试验设计是采用规格化的正交表，使试验因素和水平得到合理安排，并通过试验结果分析各因素对试验观察指标的影响，分清各因素之间的主次关系和交互作用，确定各因素不同水平的最佳组合，是多因素多水平试验效率最高的设计方法。

热应激可引起动物免疫机能下降，如引起小鼠胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞增殖活性、IL-2浓度及其受体表达均出现下降[2]，诱导胸腺细胞和脾脏细胞的凋亡，并引起动物胸腺和脾脏萎缩[3]，还可通过下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴引起皮质醇水平升高而影响动物正常的生理和免疫功能[4~6]。因此，本试验在中兽医方剂“君、臣、佐、使”组方原则的指导下，采用正交设计法研究藿香、苍术、黄柏和石膏四种中药有效部位不同组合以及不同水平对热应激后小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响，旨在探讨中药有效部位复方组方机制。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

中药有效部位：石膏水提物（gypsum fibrosumwater extract, GFWE）（硫酸钙含量为92%）、黄柏生物碱（cortex phellodendri‘salkaloid, CPA）（小檗碱含量为42.0%）、藿香挥发油包合物（herba agastachis‘saetherolea, HAA）（百秋里醇含量30.47%）、苍术挥发油包合物（rhizoma atractylodi’saetherolea, RAA）（β-桉叶油醇含量33.63%）均由本课题组制备和定量测定，临用前分别用RPMI-1640基础培养基配制成1mg/ml。

RPMI-1640基础培养基、Hank’s干粉为Hyclone公司产品；小牛血清，购自北京元亨圣马生物技术研究所；二硫苏糖醇（DTT），购自北京科昊泽生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚枫（DMSO），购自Amresco公司；Ⅱ型胶原酶、EDTA、植物血凝素（PHA）购自Sigma公司；小鼠淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。

1.2　试验方法

1.2.1　小鼠肠道淋巴细胞分离与培养

参照文献方法[7,8]分离肠道淋巴细胞，即脱臼处死18~22g BALB/c鼠，置于75%酒精中浸泡5min，取出十二指肠到回盲肠结之间的肠道组织；用含有1000IU双抗的Hank’s洗涤液反复冲洗；将肠道组织块剪成1×1cm2大小置于含1000IU双抗、5%小牛血清Hank’s洗涤液中浸泡5min，反复3次；加入20ml 37℃ EDTA-DTT消化液，间断振荡消化30min，收集消化液1000rpm离心5min以获取淋巴细胞；向剩余组织块中加入20ml 37℃的0.1%Ⅱ型胶原酶液，37℃恒温振荡水浴锅中以250rpm振荡消化40min；将剩余消化液经2层无菌医用纱布过滤；10000rpm离心滤液5min，收集细胞后用完全培养基洗涤2次；将两次收集的淋巴细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，以2000rpm离心20min，收集淋巴细胞分离液层和培养液中间的淋巴细胞层；用10%小牛血清RPMI-1640完全细胞培养基以1000rpm离心5min方式洗涤淋巴细胞2次，并经玻璃纤维棉柱过滤；经0.3%台盼蓝拒染法计算细胞活力＞90%后，用10%小牛血清完全培养基调整淋巴细胞数量为1×106个/ml，按照0.5ml/孔加入96孔细胞培养板后，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2　正交试验设计

根据正交试验设计要求，考察藿香挥发油、苍术挥发油、黄柏生物碱和石膏水提物不同水平组方对热应激小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响。即A，B，C，D，A×B，A×C，B×C，选用正交表L8（27）。因需考察A×B，就先将A放在第1列，B放在第2列由L8（27）交互作用列表查出A×B在第3列；将C放在第4列，同法查出A×C在第5列，B×C在第6列，D放在第7列。因素水平、表头设计和试验方案见表1和表2。

表1因素和水平表

因素

factor

藿香

HAA

苍术

RAA

黄柏

CPA

石膏

GFWE

种类type

A

B

C

D

1

200mg/ml

200mg/ml

200mg/ml

100mg/ml

2

100mg/ml

100mg/ml

100mg/ml

50mg/ml

表2表头设计和试验方案表

列array

1

2

3

4

5

6

7

因子

factors

藿香

HAA

苍术

RAA

藿香×苍术

HAA×RAA

黄柏

CPA

藿香×黄柏

HAA×CPA

苍术×黄柏

RAA×CPA

石膏

GFWE

1

2

3

4

5

6

7

8

1（200）

1（200）

1（200）

1（200）

2（100）

2（100）

2（100）

2（100）

1（200）

1（200）

2（100）

2（100）

1（200）

1（200）

2（100）

2（100）

1

1

2

2

2

2

1

1

1（200）

2（100）

1（200）

2（100）

1（200）

2（100）

1（200）

2（100）

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2

2

1

1

2

2

1

1（100）

2（50）

2（50）

1（100）

2（50）

1（100）

1（100）

2（50）

　1.2.3 小鼠肠道淋巴细胞处理与数据处理

向分离获得的小鼠肠道淋巴细胞悬液中加入不同浓度中药有效部位组合复方以及1mg/ml PHA后，用10%小牛血清RPMI-1640完全培养基补足至1ml，将小鼠肠道淋巴细胞放于43℃热应激1h后于37℃、65%湿度条件下培养44h，加入10ml 5mg/ml的MTT液于37℃、65%湿度条件下培养4h，加入100ml DMSO混匀于570nm波长检测OD值。数据用SPSS11.5统计软件按照正交设计法进行方差分析。

2.结果与分析

2.1直观分析

表3 中药有效部位复方对热应激小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响（直观分析表）

药物与交互作用

Medicine and interaction

藿香

HAA

苍术

RAA

藿香×苍术

HAA×RAA

黄柏

CPA

藿香×黄柏

HAA×CPA

苍术×黄柏

RAA×CPA

石膏水提物

GFWE

T细胞增殖

Proliferation of T lymphocyte

1

2

3

4

5

6

7

8

1

1

1

1

2

2

2

2

1

1

2

2

1

1

2

2

1

1

2

2

2

2

1

1

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2

2

1

2

1

1

2

2

1

1

2

2

1

1

2

2

1

2

1

1

2

0.303

0.295

0.301

0.284

0.294

0.282

0.302

0.285

T1

T2

R

1.183

1.163

0.02

1.174

1.172

0.002

1.185

1.161

0.024

1.2

1.146

0.054

1.171

1.175

-0.004

1.166

1.18

-0.014

1.171

1.175

-0.004

2.346

据表3结果直观分析可知，黄柏和藿香的极差大，故黄柏和藿香作为主药，且分别以1水平，即200mg/ml对小鼠肠道T淋巴细胞增殖促进作用最大；苍术和石膏为次要药物，其水平分别选1水平，即分别为200mg/ml和100mg/ml。即最佳组方为A1B1C1D1，以中药有效部位复方1对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖影响最大。

2.2 方差分析

表4　中药有效部位复方对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖的影响

列号

Array

1

2

3

4

5

6

7

药物与交互

A

B

A×B

C

A×C

B×C

D

Ri2

0.0004

0.000004

0.000576

0.002916

0.000016

0.000196

0.000016

SSi= Ri2/8

0.00005

0.0000005

0.000072

0.0003645

0.000002

0.0000245

0.000002

注：表中为Ri2各种药物极差的平方，SSi公式中8为复方总数。

各处理因素自由度（df）＝水平数－1

各因素的均方（MS）＝SS/df

计算误差列离均差平方和（SSe）、自由度（dfe）和均方（MSe），公式同上。即SSe＝?SS（SS2＋SS5 SS7）；dfe＝1 1 1＝32；MSe＝SSe/3＝0.0000015

F检验。F＝MS/MSe

结果判断：可查F值表。如F