摘要: 免疫亲和层析是一种有效的残留检测净化技术, 在农药和兽药中得到了广泛应用。作者对免疫亲和层析的原理、关键技术作了详细的阐述, 并且介绍了其在兽药及饲料药物添加剂残留中的应用与进展。
关键词: 免疫亲和层析;残留;净化

违禁兽药、饲料药物添加剂的残留已经给我国环境和公众健康带来了严重危害, 同时在国际贸易、进出口检验方面引起的问题也愈加明显, 因此残留检测技术对于遏制各类抗生素及B2兴奋剂的滥用有着举足轻重的作用。而药物残留检测属于复杂混合物中的痕量分析, 采用一种有效、快捷、普及的净化方法非常必要。

1　免疫亲和层析技术简介
1. 1　免疫亲和层析产生背景
残留检测的确证方法主要是仪器分析法, 如LCöM S、GCöM S 或HPLC, 这些方法中因残留组分绝对量很小, 检测方法需要较高灵敏度和准确性。样品前处理是检测技术的核心, 传统的样品净化技术主要有液—液分配(LL E)、固相萃取(SPE)、基质固相分散(M SPD )、超临界萃取(SFE) 等。但是这些净化技术通常需要多个净化步骤, 缺乏选择性, 不但费时繁琐、容易污染、损失样本且会引起严重的本底干扰, 降低结果的可靠性。因此建立高效的样本净化技术已成为痕量分析的主要问题。最近20 年, 固相提取领域研究的不断深入, 推进了从分析物中选择性萃取目标产物为目的的新技术发展(Henn ion 等, 2003)。
免疫亲和层析( immnuoaff inity chromatography, IAC) 提供了一个有效的方法, 从液体材料中进行选择净化、化合物浓缩、分类, 然后从固相支持物中提取纯化样本。20 世纪60 年代末溴化氰活化琼脂糖载体开始(A xen 等, 1967) , IAC 成为免疫化学中最有效分离手段之一。
V an 等(1987) 首次应用IAC 技术净化了猪肉中的氯霉素随后1989年又在此技术基础上测定了蛋、牛奶(V an, 1989) 中的氯霉素。其现在已成为医药、兽药、食品检测中, 前处理方法应用的重要手段。
这项技术在兽药残留中的应用特别广泛, 包括猪肉中的磺胺类药物、血浆中克仑特罗、血清中二恶英等。生物样本中爱比菌素应用免疫亲和层析的回收率也可达到80%～ 86% (LJS, 1996)。
1. 2　免疫亲和层析技术原理
IAC 也是色谱技术的一种, 可称为免疫色谱技术, 是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的SPE 技术, 根据抗原抗体的高选择性, 从复杂的待测样品中提取目标化合物。主要原理是将抗体与惰性微珠共价结合, 然后装柱, 将抗原溶液过免疫亲和柱, 而非目标化合物则沿柱流下, 最后用洗脱缓冲液洗脱抗原, 从而得到纯化的抗原, 用适当的缓冲液和合适的保存方法, 柱可以再生备用。其提纯效率很高, 通常只需一次就可达到1000～ 10000倍的纯化效果(王泽永, 2002)。

2　影响免疫亲和层析效率的关键因素
2. 1　柱容量
免疫亲和层析作用的基础是色谱法与抗原抗体的可逆反应平衡相结合理论。遵循经典的scatchard 方程, 并将平衡状态免疫反应与色谱过程联系起来。V an (1991) 详细阐述了免疫亲和柱的提纯效率, 并计算了理论灵敏度, 指出免疫亲和柱对于药物残留分析的pg 和ng 级微量都有很好的分离效率。IAC 常用的柱床体积为1m l, 因其高效特异性保留能力, 能在较小的柱容量或柱床体积下完成净化过程, 减少了非特异性吸附并节省昂贵的柱材和抗体。
2. 2　基质的选择
针对各种类型的分子, 可以选择不同的基质, 这样可以大大提高净化效率, 合适的基质对于活化剂的选择、抗体的偶联、抗原抗体相互作用及无关杂质的去除, 都有着举足轻重的作用。作为亲和柱的载体最好是均一的珠状颗粒。
溴化氰活化的琼脂糖( sepharo se) 是最经典的亲和柱的柱材, P icket t 等(1993) 应用溴化氰激活的sepharo se4B 净化了克仑特罗及其代谢物, 然后用酶联免疫分析法进行鉴定, 检测限达10 pgöm l。
对于其它的基质应用也很多, Kaster 等(1993) 对纤维素作为免疫亲和层析基质的颗粒大小、柱的耐受力、动力学容量都进行了很好的描述。Sap in 等(1976) 用戊二醛双功能试剂制成了聚丙烯酰胺凝胶(B io2gel2P) 蛋白免疫吸附剂从鼠和兔的血清中分离了抗人的IgM。
2. 3　基质的活化与抗体的偶联
活化与偶联反应条件要求温和、简单, 尽可能降低对抗体活性和基质结构的破坏。基质活化通常在骨架上引入强亲电基团, 然后与抗体上亲核基团如- NH2、- OH、- SH等发生取代反应, 使抗体连接于基质上(偶联)(Katz, 1992)。V an 等(1988) 用IAC2HPLC 及薄层层析(TLC) 技术, 检测药物机动剂群勃龙(TBA )。其IAC 中琼脂糖凝胶活化使用2, 2, 2-三氟乙烷磺酰氯( t resyl2ch lo ride)。HPLC-UV 进行检测, 检测限为1～ 2 μg/L 。TLC 可分离17B2TBA 与17A-TBA , 检测限0. 5μg/L。V an (1987) 净化猪肉中氯霉素, IAC 活化剂选用溴化氰, 洗脱液用甲醇。而净化蛋、牛奶中的氯霉素, IAC 活化剂则选用碳酰二咪唑, 洗脱液用0. 2M 甘氨酸与0. 5MN aCl (pH 2.8) , 柱可用30 次, 柱容未下降。
虽然抗体的化学特性直至20 世纪中叶才被揭示, 但抗体用为分析却已有百年历史。抗血清中的抗体含量最多的是IgG 抗体, 所以应用其制备免疫吸附剂最常用。已有人研究增加识别位点浓度的抗体结合片段的各种优点, 但实验室还没有广泛的应用,如Fab 片段可易从单抗或多抗中获得, 这种片段已被应用在线偶联毛细管电泳的免疫吸附剂。免疫亲和层析技术应用的IgG 抗体, 有两种类型即单克隆抗体(M cA b s) 和多克隆抗体(PcA b s)。与单抗相比,多抗的抗原决定基的特异性和结合特性是多样的,因此制备时使用纯抗原, 以防止其增加不必要的抗体。但是多抗包含了所有的抗体亚类, 对变性条件的抵抗力也高于单抗, 因此多抗制备的IAC 柱寿命较长。
抗 体偶联分为随机偶联和定向偶联2 种, 随机偶联的抗体随机偶联到抗体不同部位, 将导致抗体损失结合力, 完全随机偶联会损失66% 的结合力(李俊锁, 1997)。定向偶联的抗体偶联到基质后抗原结合位点指向流动相, 抗体偶联部位应为Fc 片段、末端蛋白或通过连接分子偶联。可以应用来自葡萄球菌细胞壁的P rA 与P rG 结合抗体分子的Fc 部位, 也可用胃蛋白酶水解抗体, 产生Fab 或单链抗体(Fv) , 其C 端巯基定向固定于基质。
2. 4　抗原结合能力
Preiffer 等(1987) 在评价应用单克隆抗体的免疫亲和层析中影响抗原结合能力的因素时提到, 因为抗体在结合到琼脂糖基质上是多价结合, 所以影响了抗原的结合能力, 所以在选择偶联条件时, 一定要使抗原结合能力最大化。激活剂的浓度也影响抗原结合, 他提到在使用CNB r 激活的基质时为了使抗体偶联后有较大的抗原结合能力,要试着使用不同浓度的CNB r。而且过高浓度的溴化氰活化的琼脂糖, 会使抗体蛋白偶联在胶珠外部,而不能渗透里面, 从而影响了抗原结合能力。合适的pH 能减少抗体的多点结合而提高抗原结合能力。
抗原抗体相互作用的基础是分子化学结构和立体化学, 并在二者之间形成一系列的复杂的范德华力、库仑力、疏水作用、氢键及立体构象互补。由于抗原抗体结合强度很大, 从免疫亲和柱上洗脱抗原, 是此项技术中的关键步骤。洗脱抗原时, 柱的环境必须改变, 使Ka 值下降。
2. 5　流动速率与柱压
流动速率与抗原抗体反应速度有关, 流动速率高结合反应效率低, 一般的流速在0. 4～ 4. 0m l/min。不同的反应要确定各自的最佳流速。免疫亲和柱的柱压一般低于正常柱压, 过高的压力(>3. 4×106 Pa) 会对柱产生剪切力, 破坏抗原抗体的结合, 降低柱的效率, 还有可能将柱料作为杂质混到分析物中。一般来说为了防止抗体脱落压力最大值应为0. 34×106 Pa (P reiffer 等, 1987)。

3　免疫亲和层析技术的应用
3. 1　免疫净化( innuno extract ion)
IAC 技术最简单的应用就是单纯作为样品的前处理手段, 即制备免疫亲和柱, 也称为离线(off-line) 免疫亲和色谱。现在市场已有售克仑特罗、黄曲霉毒素等多种商品化亲和柱, 使用效果非常好。Dickson 等(2003) 用IAC 提纯后, GCöM S 方法成功检测了牛尿样中己烯雌酚等雌性激素的存在, 检测能力最低达0. 15μg/L 。而根据不同的应用原理与手段, 科学家们在单纯亲和层析基础上又开发了多种应用形式。
3. 2　免疫亲和层析联用技术
IAC 联用技术也可称为在线(on- line) 免疫亲和色谱, 将IAC 提纯后的样品直接偶联于HPLC, LC/M S, GC/M S, CE 检测。与离线模式不同, 样品纯化、分析实现自动化, 主要通过柱切换技术进行连接。
20 世纪70 年代末, 刚性、高效固相支持物的出现, 使抗体固定技术应用于高效液相色谱(HPLC) ,由此产生了高效免疫亲和色谱(HP IAC)。HP IAC是在线IAC 的一种应用形式, 简化了分析过程并将分离、定性、定量一体化。HP IAC 中大多使用硅胶与玻璃免疫吸附剂, 应用于直接分析残留物还不是很普遍, 有的时候免疫亲和柱上的洗脱物的峰不是很尖, 因为解吸附作用比理论上要慢。为了解决峰平和基线不稳的问题,Moretti 等(1992) 将免疫亲和柱直接偶联到C18RP2HPLC 上测定牛奶和肉中氯霉素,IAC 柱上的洗脱液在HPLC 预柱上浓缩, 最后进入仪器的分离柱进行检测目标化合物色谱检测后没有杂质干扰, 而且3 个月内重复使用检测了150 个样本而柱容量没有降低。Farjam 等(1988) 成功的应用柱切换技术, 以IAC 作为预柱, 偶联液谱法检测牛尿中去甲睾酮, 检测限为0. 05 μg/k g。免疫亲和预柱可以使用6 个月, 净化100 多个样本而没有效率的降低。
Ben jam in 等(1997) 建立了以IAC 为基础的, 与LC/EM S 或LC/ETMS 联用的克仑特罗检测方法。
3. 3　多残留免疫亲和色谱(M IAC)
多残留免疫亲和色谱(M IAC) 更加集中了免疫亲和色谱的优势, 可在一个层析过程中提取多个样品。亲和柱上偶联一种抗体提纯几种结构相关的簇异性抗原, 或偶联多种抗体分别提纯多种交叉反应率低的分析物都是常用的方式。M IAC 对于离线和在线方式都可应用。V an 等(1989) 用此技术分析了肌肉中pg 量的去甲睾酮与甲基睾酮。琼脂糖凝胶用2, 2, 2-三氟乙烷磺酰氯活化, 结合的合成代谢类固醇用2 m l 50%乙醇淋洗,M IAC 柱依次用90% 甲醇、0. 1M 醋酸钠和磷酸缓冲液再生, 最后提取物用GC/M S 检测。回收率0. 5 μg/k g 时达80%。M IAC 净化柱可再利用25 次而没有容量损失, 检测最低水平为0. 5 μg/kg。V an 等(1992) 又建立了B-肾上腺素的多残留分析法, 以抗氮-叔丁基和氮-异丙基的2 种抗体为介导的免疫亲和层析为净化手段, 通过GC/M S 进行定性定量分析, 成功的测定了克仑特罗和塞曼特罗等一系列B2肾上腺素, 此类药物中基本具有2 个抗体结合位点中的一个。其对照试验使用的是同位素内标法, 回收率可达(101±5)%。
李俊锁(2000) 完成了磺胺类药物的免疫亲和色谱法的检测。利用抗磺胺类药物的簇特异性抗体制备免疫亲合柱, 能够同时提取复方磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶碱、磺胺嘧啶、磺胺喹恶啉等8 种磺胺类药物。
反相色谱紫外检测猪肉中添加10～ 100 μg/kg 时, 回收率为70. 8%～ 94. 1% , 检测限达到1～ 2 μg/kg。
3. 4　放射荧光检测法
放射荧光检测法也是一种很好的定量方法。Shelver 等(2002) 应用免疫亲和层析的样本净化技术检测B2肾上腺素兴奋剂莱克多巴胺及其代谢物。他们以单克隆抗体为配基, 并结合了放射性亲和层析作为检测方法。[ 14C ]莱克多巴胺和[ 14C ]
莱克多巴胺类似物添加入牛尿, 用RAC2IAC 方法净化检测, 其净化后所有样本包括肝、肾、肌肉, 都能继续做液相色谱分析和液体闪烁计数仪的检测。
3. 5　后柱免疫检测(postcolum nimm unodetection)
色谱免疫分析法也能检测其他色谱柱的洗脱液(Hage 等, 2001) , 主要是把固定抗体的后柱或固定有类似物的柱接于HPLC 的接口处, 然后进行直接检测或免疫测量分析。如将HPLC 柱流过液与含有标记抗体或Fab片断的溶液相混合, 然后将混合液通过固定有分析类似物的柱, 与抗体或Fab 片断结合的分析物会流过柱, 达到检测器。地高辛、生物素都用此法进行检测过。
3. 6　其他色谱免疫分析法
色谱免疫分析法包括竞争结合免疫分析、免疫测量分析、同质免疫分析及酶联免疫亲和色谱等很多种。但是这些方法主要的应用是在医学检测方面。随着农业现代化的推进, 兽药、添加剂残留检测也会逐步向这一方向发展, 提纯、检测一体化, 一直是我们的目标。

4　结语
以低分子量分析物为目标的免疫化学方法是现在兽药残留检测的发展趋势, 免疫亲和色谱作为理化测定技术的净化手段, 可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体, 避免了IA 直接测定样品信息量太少、假阳性或理化分析技术选择性低等不足, 虽然其在残留分析中的研究与应用尚属于探索阶段, 但已展示了广阔的发展前景。尤其是色谱免疫分析法结合了色谱的高效性和免疫的特异性, 是残留分析的主要研究方面。而且一旦拥有了大量性质均一的纯抗体, 如单抗或工程抗体, 这项技术发展的潜力非常之大, 它的净化效率也是其它净化方法无法比拟的。