1 材料与方法
1.1 病料: 收集于广西（包括南宁、北海、玉林三个主要养鸡地区）、江苏、浙江、安徽各地的临床疑似IBD的病鸡及其有肿大、出血以及炎症渗出物等病变的法氏囊组织以及骨髓和脾脏。
1.2 鸡胚: 9天龄健康鸡胚，分别购自南宁市良凤农牧有限责任公司和广西华桂源种禽有限公司。yz.ag365.comyz.ag365.com
1.3 试剂: M-MLV逆转录酶（2.5U/µL）、Taq DNA聚合酶（2.5U/µL）、dNTPs (25mmol/L)、MgCl2(25mmol/mL)、10×PCR Buffer以及组织样品RNA抽提的UNIQ—10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒, 均购自上海生工生物工程有限公司；限制性内切酶SspⅠ（10U/µL）和SacⅠ（10U/µL），购自东洋坊；Agarose Gel DNA Purification Kit，购自TakaRa公司；其它所用试剂购自其它商业试剂公司并均为分析纯产品。
1.4 IBDV商品疫苗毒株：分别从疫苗市场购得，见表1。yz.ag365.comyz.ag365.com
1.5病料核酸的检测： 1.5.1 病料处理 采集到的法氏囊组织、骨髓和脾脏，经剪碎，按1:5比例加入灭菌生理盐水制成悬液，反复冻融三次，3000转/min 离心5min，取上清保存备用。 1.5.2 RNA的抽提 病料组织悬液的上清使用UNIQ—10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒并按其产品说明进行RNA的抽提，最后加入无RNA酶的双蒸水25µL溶解抽提的RNA，立即进行反转录或-20℃保存。 1.5.3 反转录合成cDNA 取抽提的RNA样品14.5 µL，加入随机引物1 µL（25pmol/ µL），70℃作用5 min.，置-20℃冰浴作用5 min.，然后加入5×RT Buffer 5 µL、dNTPs 2 µL、Rnasin 0.5 µL、M-MLV逆转录酶1 µL，混匀，置42℃反转录1 h，96℃灭活反转录酶5 min，即得cDNA。获得的cDNA可直接用于PCR扩增或置-20℃保存待用。 1.5.4 vVP2片段的PCR扩增 扩增的引物及其反应参数参照韦 平等[6]和龙进学等[7]的方法进行。具体操作步骤如下：在反应管中加入3µL经反转录获得的cDNA、10×PCR Buffer2.5µL、MgCl21.5µL、引物0.5µL (50pmol/µL)、dNTPs0.5µL、TagDNA聚合酶0.6µL，加灭菌双蒸水至25µL，按如下程序进行PCR扩增：95℃，3min；94℃，30s；58℃，30s；68℃，1min；94℃→58℃→68℃三个步骤共循环35次；最后68℃延伸7min后终止反应。预期扩增的目的片段大小约为471bp。 1.5.5 琼脂糖凝胶电泳分析扩增的结果 取6 µL PCR扩增产物与2µL 6×Loading Dye Solution混合，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上以60-80V电压进行电泳50-60min，在凝胶成像系统下观察结果并拍照记录。 1.6 病毒分离： 1.6.1 病料处理 取1.5.1制备的上清经0.45微米滤膜过滤除菌或按每毫升悬液2000单位的比例加入双抗（青霉素和链霉素），4℃过夜，经血平板划线确定无菌后-20℃保存备用。 1.6.2 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）接种分离病毒 取1.6.1中获得的病料处理液按0.2mL/枚经CAM各分别接种2枚9天龄鸡胚，置37℃孵育，每12h照蛋检查一次，弃去24h内死亡的鸡胚。24h后死亡的鸡胚在无菌下剖解，观察鸡胚有无肉眼可见的病变，同时取其尿囊液进行血凝试验（HA）和鲜血平板的细菌培育。连续盲目传代2-3次，直至鸡胚出现死亡和明显病变，收集其尿囊液、绒毛尿囊膜及病变明显的胚体。 1.6.3 接种鸡胚成纤维细胞分离病毒 取1.6.1中获得的病料处理液按0.1mL/瓶均匀滴加入到预先做好的CEF单层，37℃吸附40-60min后吸去病料液，加入新鲜细胞培养液，每天观察细胞病变（CPE）。yz.ag365.comyz.ag365.com 1.6.4 病毒分离物vVP2的RT-PCR扩增与鉴定 收集死亡鸡胚的绒毛尿囊膜及胚体，按1.5所述的具体方法进行IBDV核酸的检测。 1.7 分离株vVP2的限制性内切酶分析： 取1.6.4获得的PCR产物用SspⅠ和SacⅠ两个限制性内切酶进行酶切分析： SacⅠ酶切反应体系 PCR产物5µL、10×L buffer 1µL、SacⅠ2U，灭菌双蒸水补足10 µL； SspⅠ酶切反应体系 PCR产物5µL、10×Basal Buffer 1µL、SspⅠ2U，灭菌双蒸水补足10 µL。 上述样品混匀后，置37℃水浴锅中消化过夜（＞10h），然后取消化液进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切的结果。 1.8 分离株vVP2基因序列的测定与分析： 1.8.1 PCR产物的纯化 取1.6.4中获得的vVP2扩增产物，采用TakaRa公司的试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit并按其说明书进行纯化。 1.8.2 DNA序列的测定 将纯化后的PCR产物交由上海鼎安生物科技有限公司进行DNA序列的测定。yz.ag365.comyz.ag365.com 1.8.3 vVP2基因序列的比较分析 应用DANStar软件对本试验所分离到毒株的vVP2序列与GenBank所公布的其他参考毒株的序列进行比较分析，同时绘制其遗传系谱树。 2 结 果 2.1 临床病料IBDV核酸检测的结果： 从具有肿大、出血以及炎症渗出物等病变的法氏囊组织病料样品中均可直接扩增出IBDV特异性的目的带（471bp），证实样品中均含有IBDV。部分病料样品的检测结果见图1。 2.2 病毒分离的结果： 2.2.1 鸡胚接种的表现 盲传2代后，接种的病料样品均可使鸡胚在接种后44-96小时内死亡。取出其尿囊膜及胚体，可见膜增厚并有白色痘斑；胚体表现为全身皮下严重出血，头颈部和四肢末端有出血，剖开胚体偶尔可见肝脏表面有坏死点。对死亡鸡胚尿囊液进行的HA试验和细菌培育检查均为阴性。yz.ag365.comyz.ag365.com 2.2.2 CEF培养的结果 病料接种细胞传至第二代后，病毒开始适应鸡胚并接种89小时后开始出现细胞变圆，随后变圆的细胞增多，部分死亡和脱落，瓶底可看到空泡的出现。yz.ag365.comyz.ag365.com 2.2.3 分离物RT-PCR的鉴定结果 对死亡的鸡胚或出现细胞病变的细胞分别取其尿囊液和收获的细胞毒进行IBDV 的RT-PCR鉴定。结果共有20份样品均扩增出471bp 的IBDV特异性目的带（见图2）。证实从病料中成功分离到了20株IBDV。yz.ag365.comyz.ag365.com 2.3 分离株PCR产物SacⅠ/ SspⅠ酶切分析的结果： 2.3.1 SacⅠ酶的酶切分析的结果 共有040124、040131、YL052、BH15、YY2、050045、050057、050258、TSC-1（3）、A038十个分离株的vVP2基因扩增产物（471bp）被SacⅠ酶切产生344 bp和127bp的两条带，具有cIBDV的特征（见图3）。yz.ag365.comyz.ag365.com 2.3.2 SspⅠ酶的酶切分析的结果 共有YL051、BH09、BH11、YY1、YY6、050222、JS1、 JS7、TSC-2（9）、TZ③十个分离株的vVP2基因扩增产物（471bp）被SacⅠ酶切产生271bp和200bp的两条带，具有vvIBDV的特征（见图4）。yz.ag365.comyz.ag365.com 2.4 分离株vVP2基因序列测定的结果及对比分析： 2.4.1核苷酸序列测定的结果及对比分析 22株分离株和5株中等毒力商品疫苗株的 VP2基因高变区的测序结果表明，与已发表的IBDV血清Ⅰ型毒株相比，没有发现核苷酸的缺失或插入，同源性在90.9%-100%之间，与国内外其它参考株的同源性在88%-100%之间；其中050222、BH11、BH09、JS1、JS7、TSC-2(9)、TZ(3)、YL051、YY1、YY6十株属于vvIBDV的分离株与日本分离株OKYM及国内分离株JS30-99的核苷酸序列同源性较高，分别为97.5%~100%和97%-98.7%；020180、050045、050057、050258、A038、TSC-1(3)、YLZF2、YY2、040131、BH15十株与常用商品弱毒疫苗株B87(BJ)的核苷酸序列同源性较高，在94.03%-100%之间；040124、YL052两株分离株与中等及偏强毒力商品疫苗株的核苷酸序列同源性在99.2%以上。 2.4.2 vVP2的氨基酸序列及其对比分析 根据测定的22株IBDV分离株的核苷酸序列推导出其氨基酸序列，并进行比较分析，结果050222、BH11、BH09、JS1、JS7、TSC-2(9)、TZ(3) 、YL051 、YY1 、YY6共十株分离株vVP2内毒力相关位点的氨基酸分别为222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S，均符合vvIBDV的特征； BH15、020180、050045、050057、050258、A038、TSC-1(3)、 YLZF2、YY2 、040131共10株分离株vVP2内毒力相关位点的氨基酸分别为222P、249Q、254G、256V、279N、284T、294L、299N，均符合弱毒疫苗株的特征；而040124、YL052两株分离株既具有强毒株的特征即在326、328、330和332位富含丝氨酸的七肽区（SWSASGS）和279D，但同时也具有284T的弱毒株特征，另外还具有242I 的vvIBDV特征，与参考毒株B87(in)和FW2512完全一致。22个分离株及5个参考疫苗株vVP2内毒力及抗原相关位点的特征性氨基酸变化具体见表2。 2.5 绘制的遗传系谱树及其分析： 根据测定的核苷酸绘制的系谱树发现，22个IBDV分离株可明显分为2群，属于cIBDV的第1群为10个弱毒分离株及2个中等偏强毒力的分离株，前者与美国经典弱毒株CU1和中等毒力疫苗株B87(BJ)、后者与中等及偏强毒力商品疫苗株B87（in）、FW2512、Bursine-2的亲源关系最近；属于vvIBDV的第2群的10个分离株则在另一个分支上，与同属vvIBDV的其它分离株JS30-99、JS1、 JS 7、SD1-97、GX8-99、OKYM、、DV86和UK661等的亲源关系较近，见图5。 2.6 分离株及其来源病例的基本情况分析： 试验分离到的20株IBDV地方流行株及其来源病例的基本情况列于表3。yz.ag365.comyz.ag365.com 3.1对收集于广西、江苏、浙江、安徽各地发生的临床疑似IBD病鸡的法氏囊、脾脏和骨髓组织，经RT-PCR技术检测为阳性后，用9天龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行病毒分离。盲传2-3代后，可使鸡胚在接种后44-96小时死亡或细胞病变产生。死亡鸡胚均具有被IBDV感染的特征性病变：尿囊液呈淡绿色，膜由于增厚而变得浑浊，胚体表现为全身皮下严重出血，头颈部和四肢末端有出血，剖开胚体偶尔可见肝脏表面有坏死点。经RT-PCR技术鉴定，证实成功分离到20株IBDV毒株，同时说明IBDV的感染广泛存在于鸡群中。 3.2 用来分离病毒的病料17份为法氏囊组织，且法氏囊都表现为不同程度的肿大、充血、出血，有些甚至呈紫葡萄样，有的有粘液和干酪样渗出物；另外3份分离病料则为骨髓和脾脏，脾脏表现肿大。法氏囊、骨髓和脾脏均是机体的免疫器官，其中的B淋巴细胞是IBDV的靶细胞，这必然导致鸡群的免疫器官受到严重损害，从而导致患病鸡的免疫功能受到严重破坏，使鸡的免疫力和抗病力都明显降低[2-7]。本研究中用来分离病毒的病料的临床调查发现，患病鸡群均普遍表现为生长阻滞、生产性能下降、疫苗免疫效果不佳等，而且均有不同程度的细菌继发感染（如大肠杆菌）、球虫感染和其它病毒性疾病的感染（如NDV、MDV和CIAV），这可能是鸡群免疫力和抗病力下降的表现之一，也可能是导致目前临床上鸡群多疾病易暴发，临床症状复杂，使养禽业的疫病更加严重和复杂的原因之一。yz.ag365.comyz.ag365.com 3.3 采用SspⅠ和SacⅠ两个特异性核酸内切酶对20个分离株进行分型鉴定，结果有10个分离株具有SspⅠ酶位点而无SacⅠ酶位点，属于vvIBDV；另外10个分离株则均有SacⅠ酶位点而无SspⅠ酶位点，属于cIBDV；而未发现有vIBDV的流行。因此，采用REA可快速的对IBDV流行毒株的致病型进行初步鉴定，但对分离到的cIBDV是属于强毒株还是弱毒疫苗株还有待进一步的研究。有资料表明具有BstNⅠ和StyⅠ酶切位点，即222位氨基酸未发生变异的毒株是经典强毒株[11]。yz.ag365.comyz.ag365.com 3.4对分离自广西（包括南宁、北海、玉林）、江苏、浙江、安徽四个省的22个IBDV现场流行株vVP2的核苷酸序列（GenBank 登录号为DQ656494-DQ656498、DQ656500-DQ656507、DQ656511、DQ656513、DQ656514、DQ656518-DQ656522、DQ659246）及推导的氨基酸序列进行了比较分析。与cIBDV毒株相比，10个vvIBDV分离株在一些关键位点发生了与欧洲、香港、日本及中国的vvIBDV一致的变异即222P-A、242 V-I、253H-Q、256V-I、294L-I、299N-S，与vvIBDV的欧洲分离株DV86、香港分离株HK46、日本分离株 OKYM、中国分离株GX8/99完全一致，可视为vvIBDV的特征性氨基酸，与vIBDV的222T/S/Q、249K、254S也有差别（见表2），10个分离株在七肽区是完全保守的，即SWSASGS；而另外10个分离株在第222、242、253、279、284位特征性氨基酸分别为P、V、H、N和T，与弱毒疫苗株完全一致；余下的2个分离株040124和YL052，在242V-I、253H-Q、279N-D发生了与vvIBDV相一致的变异，七肽区也完全保守，而222L与中等及偏强毒力商品疫苗株相同，284T则符合弱毒疫苗株的特征，与5株中等及偏强毒力商品疫苗株以及GenBank上发表的其它同类毒株的核苷酸序列同源性在90.1%-100%之间，而与其中B87（in）、FW2512两个中等偏强毒力商品疫苗株的核苷酸同源性更高达100%，因此应属于这些中等偏强毒力疫苗株先前在鸡群中使用后，造成场地污染而感染易感鸡所致[12]。 3.5研究的22个IBDV分离株分别分离自广西、江苏、浙江、安徽四个省，病料采集时间为2000-2005期间。虽然其中2003年的一株A038在345（A-T），2005年的一株JS1 348（P-S）、350（T-P）发生了与其它所有毒株均没有出现的氨基酸位点变化，但不具有毒力差异的特征，但所有毒株VP2基因高变区的序列在时间和地域上无明显的差异，证明这些地区流行的毒株在过去的这一段时间里其VP2基因高变区并没有发生明显的特征性的变异，保持相对的恒定。因此，根据本研究的试验结果可以得出结论：目前我国部分省区IBDV流行的毒株主要为vvIBDV。应成为当前IBDV的防治重点。 3.6从法氏囊等器官有病变的个体中分离到的10个弱毒疫苗株及2个中等偏强毒力疫苗株，我们认为可能是由于该鸡群先前或同时感染了vvIBDV毒株所致。因为我们在分离到弱毒疫苗株的同一鸡群的不同个体中大多（8/12）同时分离到了vvIBDV。由于疫苗毒株已经适应鸡胚，所以在采用鸡胚接种来进行病毒的分离时，病料样品中的疫苗毒株容易在培养的第一代就可致死鸡胚或引起明显的鸡胚病变，而野毒株则需要传2-3代适应鸡胚后方可引起类似相同的病变。 主要参考文献： [1] B.W卡尔尼克主编，高福、刘文军主译. 禽病学（第十版）[M]. 北京：中国农业出版社，1997. [2] 韦平，丁家波. 几种引起家禽免疫抑制的病毒性疾病及其作用机理[J]. 中国预防兽医学报. 2000， 22（4）：316~318 [3] 阳秀英，韦平，韦信贤. 威胁家禽健康与福利的免疫抑制性疾病及其防制原则(上)[J]. 养禽与禽病防治，2006，（6）：10~11 [4] 阳秀英，韦平，韦信贤. 威胁家禽健康与福利的免疫抑制性疾病及其防制原则(下)[J]. 养禽与禽病防治，2006，（7）：40~42yz.ag365.comyz.ag365.com [5] Yegani M, Butcher G D, Nilipour A H. Immunosuppression-threat to bird health and welfare [J]. World Poultry. 2005, 21(2):18~22 [6] 韦平，龙进学，阳秀英等. 传染性法氏囊病病毒（IBDV）快速检测与分型技术[J].中国兽医学报，2004，24（4）：313~316 [7] 龙进学，韦平、阳秀英. 传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用[J].广西大学学报（自然科学版），2003，28（2）：103~108 [8] 周继勇，于涟，李双茂. 浙江地区传染性法氏囊病病毒野毒株的血清亚型分析[J].中国预防兽医学报，1999，30（6）：567~573 [9] 周继勇，李建荣. 传染性法氏囊病病毒变异株弱毒的遗传稳定性与免疫原性[J]. 中国兽医学报，2000，20（4）：317~320 [10] 曹永长，毕英佐，梁志清等. 超强传染性法氏囊病病毒株保护性抗原的分子特征[J].中国兽医学报.1998，18（6）：521~526 [11] Jackwood, D J, R J Jackwood, and S E Sommer. Identification and comparison of point mutations associated in classic and variant in factious bursal disease viruses [J]. 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