肠炎沙门氏菌属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一，宿主包括人和各种动物。该菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失，而且被污染的家禽产品作为肠炎沙门氏菌的携带者，还严重危害人类健康。据报道，日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40％～80％是由禽沙门氏菌引起的，其中主要病原为肠炎沙门氏菌(S G Mellroy,et al.1989)。由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎（食物中毒），在世界各国有增加的趋势，已成为国际公共卫生的一个重要课题。1989年3月世界卫生组织专门召开了一次有关家禽及禽蛋中肠炎沙门氏菌污染问题的紧急国际会议（Impey C S, et al.1989）。
目前，国内对鸭感染肠炎沙门氏菌的研究不多，1988年郭玉璞等报道了北京西郊某鸭场两周龄左右的鸭群中，两度发生肠炎沙门氏菌感染，死亡率为43％，造成很大的经济损失。当时选用氯霉素(现禁用于食品动物)防治，取得满意的效果；张欣萍等对添加乳糖和嗜酸性乳酸杆菌对鸡肠炎沙门氏菌感染的治疗效果作了报道。查阅相关资料，国内对制作肠炎沙门氏菌灭活苗的研究尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
试验所用肠炎沙门氏菌（S.enteritidis RS307），为本实验室从水禽病例中分离，经本实验室、中国医学细菌保藏管理中心志贺氏菌专业实验室和卫生部成都生物制品研究所鉴定，本实验室保存。
1.2 实验动物
“南海黄”1日龄雏鸡，广东食品集团南海联营种鸡场提供。樱桃谷1日龄雏鸭，佛山科学技术学院种鸭场提供。SPF级小鼠，广东省医学实验动物中心提供。番鸭，购自非疫区的健康番鸭。所选用的禽只泄殖腔拭子沙门氏菌检验阴性。
1.3 培养基
普通肉汤、普通琼脂斜面、鲜血琼脂斜面、三糖铁斜面、S.S.琼脂等培养基粉，由广东环凯微生物科技有限公司提供。按说明及常规法配制。
1.4 菌悬液制备
取保存的肠炎沙门氏菌（S.enteritidisRS307）菌株，接种S.S.琼脂平板，挑取典型菌株接种于营养肉汤培养18 h作为种子液，然后再接种于营养琼脂瓶中，置37℃培养18 h，对无杂菌污染的克氏瓶及时用灭菌生理盐水浸泡数分钟后刮下菌苔，用灭菌纱布过滤至无菌瓶中。经细菌计数后备用。
1.5 菌悬液灭活试验
1.5.1 甲醛灭活试验
取200ml菌悬液置20支试管中，每支各10ml，分别按菌悬液的0.1％、0.2％～1％将甲醛加入菌悬液中，每个浓度设1个重复，置37℃培养，12h、24h时分别将各浓度的灭活菌悬液接种于营养肉汤和普通琼脂平板培养基中，培养24h，营养肉汤和普通琼脂平板均无细菌生长的最低甲醛浓度判为甲醛灭活肠炎沙门氏菌所需的最低浓度。
1.5.2 高温灭活试验
取120ml菌悬液置60支试管中，每支各2ml，分为6组，分别置50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴箱中，每个温度分别作15min、30min、60min、90min、120min 5组处理，每个处理分别设置1个重复。将各温度不同处理时间的灭活菌悬液接种于营养肉汤和普通琼脂平板培养基中，培养24h，营养肉汤和普通琼脂平板均无细菌生长的最低温度和最短时间判为该温度灭活肠炎沙门氏菌所需的最短时间。
1.6 灭活苗制备
参照《兽医生物制品学》相关方法(王明俊,等.1997.)，肠炎沙门氏菌菌种经繁殖后,选菌、增菌培养，接种于普通肉汤培养基中，振荡通气培养24 h,培养物经检验纯粹后，按菌液量的0.2%加入甲醛溶液，37℃灭活24h，灭活菌液经无菌检验合格后,混合均匀，定量分装备用。
1.7 防制效果试验
1.7.1 免疫产生期测定
取90只SPF级约30g小鼠，随机分为9组，每组10只，1、2、3、4、5、6、7、8组分别按0.3ml/只，于腹部注射接种自制灭活疫苗。分别于接种免疫后的2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天接种肠炎沙门氏菌攻毒，每只小鼠腹部注射0.5ml肠炎沙门氏菌肉汤培养物稀释液。第9组为对照组，不免疫，只攻毒。各组喂以相同的饮水和饲料。观察其免疫保护效果。
1.7.2 最佳免疫剂量测定
1.7.2.1 小鼠
取110只SPF级约30 g小鼠，随机分为11组，每组10只，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10组为试验组，每只分别于腹部注射接种0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml自制灭活疫苗；第11组为对照组，只攻毒，不接种疫苗。接种免疫第10天，每只小鼠腹部注射0.5 ml肠炎沙门氏菌肉汤培养物稀释液。各组喂以相同的饮水和饲料。
1.7.2.2 雏番鸭
取110只1日龄雏番鸭,适应饲养5天，随机分为11组，每组10只，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10组为试验组，每只分别于腹部注射接种0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml自制灭活疫苗；第11组为对照组，只攻毒，不接种疫苗。接种免疫第12天，每只雏番鸭胸肌注射0.5ml沙门氏菌肉汤培养物稀释液。各组喂以相同的饮水和饲料。
1.7.3 保护试验
1.7.3.1 小鼠
取132只SPF级约30g小鼠，随机分为1、2、3组，每组各44只，第1组为试验组，每只腹部注射自制灭活苗0.3ml；第2组为感染对照组，只攻毒，不进行疫苗免疫以作对照；第3组为健康对照组不免疫，不攻毒；于第1组免疫第10天，一起给试验组和感染对照组予强毒攻击，每只小鼠腹部注射0.5ml肠炎沙门氏菌肉汤培养物(1.0×109 cfu/ml)，观察其免疫保护效果。
1.7.3.2 雏番鸭
取132只1日龄雏鸭，适应饲养5天，随机分为1、2、3组，每组各44只，第1组为试验组，每只颈部皮下注射自制灭活苗0.5ml；第2组为感染对照组，只攻毒，不进行疫苗免疫以作对照；第3组为健康对照组不免疫，不攻毒；于第1组免疫第12天，一起给试验组和感染对照组予强毒攻击，每只肌肉注射0.5ml肠炎沙门氏菌肉汤培养物(1.0×109 cfu/ml)，观察其免疫保护效果。
1.7.3.3 “南海黄”雏鸡
取132只1日龄雏鸡，适应饲养15天，随机分为1、2、3组，每组各44只，第1组为试验组，每只颈部皮下注射灭活苗0.5ml；第2组为感染对照组，不进行疫苗免疫以作对照；第3组为健康对照组不免疫，不攻毒；于第1组免疫第12天，一起给试验组和感染对照组予强毒攻击，每只肌肉注射0.5ml肠炎沙门氏菌肉汤培养物(1.0×109 cfu/ml)，观察其免疫保护效果。
1.8 田间免疫试验
1.8.1 禽群的选择与分组
在佛山地区的南海、三水、高明选择曾经出现肠炎沙门氏菌感染的养禽场，每个地方选择“南海黄”鸡场、樱桃谷鸭场、番鸭场各2个，每个禽群不少于2 000只禽，将每个禽群的禽只平均分为两组，其中一组注射肠炎沙门氏菌灭活苗，另一组不注苗作为对照。在相同的饲养条件下，观察禽群的生产性能及因肠炎沙门氏菌病的死亡率。
1.8.2 接种疫苗的时间、免疫剂量和方法
鸭只在7天龄注苗，鸡只在15天龄注苗。每只颈部皮下注射灭活苗0.5ml，对照组不作注射。
1.9 安全性试验
以最佳剂量的4倍剂量腹部和胸部注射，分别接种未经免疫的10只小鼠和10只雏番鸭，观察接种后的反应，观察期为10天。
2 结果
2.1 菌悬液灭活试验
2.1.1 甲醛灭活试验
按菌悬液总量的0.2％加入甲醛，37℃处理24h或按总量0.3％加入甲醛灭活12 h，即可灭活肠炎沙门氏菌。结果见表1
表1 甲醛灭活肠炎沙门氏菌的结果
处理时间 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％ 0.5％ 0.6％ 0.7％ 0.8％ 0.9％ 1.0％
甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛 甲醛
12 h + + － － － － － － － －
24 h + － － － － － － － － －
注：“+”表示经处理后仍然有细菌生长，“－”表示经处理后没有细菌生长
2.1.2 高温灭活试验
50℃处理120 min或60℃处理30 min，即可灭活肠炎沙门氏菌。结果见表2。
表2 高温灭活肠炎沙门氏菌的结果
处理 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min
50℃ + + + + －
60℃ + － － － －
70℃ － － － － －
80℃ － － － － －
90℃ － － － － －
100℃ － － － － －
注：“+”表示经处理后仍然有细菌生长，“－”表示经处理后没有细菌生长
2.2 最佳免疫剂量测定
2.2.1 小鼠
结果见表3。可以看出，以0.3 ml/只剂量免疫，比以0.2 ml/只剂量免疫的效果好，而以0.4ml/只～1.0 ml/只剂量免疫的效果与0.3 ml/只剂量的免疫效果差异不大。因此，我们选0.3ml/只，作为灭活苗对小鼠的最佳免疫剂量。
2.2.2 雏番鸭
结果见表3。可以看出，以0.5 ml/只剂量免疫，比以0.4 ml/只剂量免疫的效果好，而0.6ml/只～1.0 ml/只剂量免疫的效果与0.5 ml/只剂量的免疫效果差异不大。因此，我们选用0.5ml/只，作为正常的免疫剂量。
表3 最佳免疫剂量测定结果
组别 实验动物 疫苗接 攻毒剂量 死亡数(只) 保护率(%)
小鼠 番鸭 种剂量 （1.0×109cfu/ml） 小鼠 番鸭 小鼠 番鸭
1 10 10 0.1 ml/只 0.5 ml/只 6 7 40 30
2 10 10 0.2 ml/只 0.5 ml/只 4 7 60 30
3 10 10 0.3 ml/只 0.5 ml/只 0 6 100 40
4 10 10 0.4 ml/只 0.5 ml/只 1 3 90 70
5 10 10 0.5 ml/只 0.5 ml/只 0 1 100 90
6 10 10 0.6 ml/只 0.5 ml/只 0 0 100 100
7 10 10 0.7 ml/只 0.5 ml/只 1 1 90 90
8 10 10 0.8 ml/只 0.5 ml/只 0 0 100 100
9 10 10 0.9 ml/只 0.5 ml/只 1 0 90 100
10 10 10 1.0 ml/只 0.5 ml/只 0 0 100 100
11 10 10 - 0.5 ml/只 7 9 30 10
2.3 免疫产生期测定
结果见表4。免疫的第10天，小鼠即可产生较强保护力，能抵御肠炎沙门氏菌强毒攻击。
表4 免疫产生期测定结果
免疫后天数 动物数 存活数 保护率(%)
2 10 3 30
4 10 2 20
6 10 6 60
8 10 8 80
10 10 10 100
12 10 9 90
14 10 10 100
16 10 10 100
对照组 10 2 20
2.4 灭活苗保护试验
结果见表5。于免疫的第12天，实施强毒攻击，肠炎沙门氏菌灭活苗对禽群的保护率达93.2％以上，而未免疫对照组的自然保护率低于25％，肠炎沙门氏菌灭活苗对小鼠、番鸭、“南海黄”雏鸡的免疫保护指数PI分别为：91.3％、90％、90.1％。
表5 肠炎沙门氏菌灭活苗免疫试验结果
组别 实验动物 存活数(只) 保护率（％）
小鼠 番鸭“南海黄”雏鸡 小鼠 番鸭“南海黄”雏鸡 小鼠 番鸭 “南海黄”雏鸡
试验组 44 44 44 42 41 41 95.5 93.2 93.2
感染组 44 44 44 11 10 11 25.0 22.7 25.0
对照组 44 44 44 44 44 44 100.0 100.0 100.0
2.5 田间免疫试验
结果见表6。经免疫后，使禽群因肠炎沙门氏菌感染的死亡率分别由原来的3.85％、4％、2.96％下降至0.5％、0.5％、0.4％。
表6 免疫试验结果
“南海黄”雏鸡 樱桃谷雏鸭 雏番鸭
免疫 对照 免疫 对照 免疫 对照
南海5 000 5000 2500 2500 1500 1 500
3 500 3 500 3000 3000 2300 2300
高明4 000 4000 3 500 3 500 1200 1200
4 000 4 000 3 000 3 000 1 500 1 500
三水 4 500 4500 4 000 4 000 3 000 3 000
4 000 4 000 2 000 2 000 2 500 2 500
总死亡数775 1 975 774 1 314 384 624
总死亡率(%) 3.1 7.9 4.3 7.3 3.2 5.2
SE病死亡数 126 963 98 721 52 356
SE病死亡率(%) 0.5 3.85 0.5 4 0.4 2.96
表7 疫苗安全性检验结果
批号 番鸭数 注射剂量存活数 10天观察期
（ml/只） 生长情况 剖杀眼观病变
0614 10 2 10 正常 无异常变化
0723 10 2 10 正常 无异常变化
0916 10 2 10 正常 无异常变化
1019 10 2 10 正常 无异常变化
1102 10 2 10 正常 无异常变化
1222 10 2 10 正常 无异常变化
2.6 安全性试验
结果见表7。不同批次疫苗以正常免疫剂量的4倍量接种7日龄雏番鸭，在10天观察期内均健活，无明显临床症状。
3 讨论和小结
3.1 安全性检验、免疫效果试验、田间试验表明，灭活苗的主动免疫可以防制肠炎沙门氏菌病，所制备的肠炎沙门氏菌灭活疫苗安全、有效，注射免疫10天即可产生较强保护力，能够抵御肠炎沙门氏菌的侵袭。临床可应用肠炎沙门氏菌灭活苗防制肠炎沙门氏菌病。
3.2 虽然国内对家禽感染肠炎沙门氏菌的报道不多，但并不代表家禽感染肠炎沙门氏菌的实际病例不多，肠炎沙门氏菌感染病例的临床表现与大肠杆菌病或鸭疫里默氏杆菌感染具有一定的相似性，基层兽医在大多数情况下，都无法作病原的分离鉴定，对这类疾病的防制具有一定的盲目性，效果自然是不理想。
3.3 据资料介绍，国外制作的含三种噬菌体型的鸡用肠炎沙门氏菌灭活苗具有良好的效果。本研究虽然未确定所选制苗菌株的噬菌体型，但该灭活苗对多种实验动物及田间试验的免疫效果是令人鼓舞。
3.4 陈荣添、蒙惠兰、王章云等分别报道了因食用被肠炎沙门氏菌污染的生日蛋糕、黄豆酱或其他食物而引起食用者食物中毒病例(王章云等,1999;陈荣添等,1998;蒙惠兰,1997)，虽然近几年国内肠炎沙门氏菌引起的食物中毒事件不算太多，但是肠炎沙门氏菌具有高致死性，具备其他烈性传染病的特征，而且国人有吃凉拌菜、熟食、生鱼等易被污染的食品的习惯，肠炎沙门氏菌应引起高度重视，以防不测。
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