2013年1月，猪流感病毒（H1亚型）ELISA抗体检测试剂盒获得农业部审批，被批准为二类新兽药【证书号：（2013）新兽药证字5号】，该试剂盒是由华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司和武汉中博生物股份有限公司共同研制，本刊特邀请该试剂盒的研制单位之一;武汉科前动物生物制品有限责任公司对该产品的研发、特点及临床应用作一介绍，为该试剂盒在临床上的应用提供依据。
一、研发背景
1.立项目的及意义
猪流感病毒(SIV)属正粘病毒科成员，可引起猪流感（SI）。SI是一种以突然发病、咳嗽、呼吸困难、发热和衰竭，以及随后的迅速恢复或死亡为特征的急性感染的呼吸系统疾病。各品种、性别和年龄的猪均能感染，发病率高。猪群暴发流感时，发病率可高达100%。近年来中国的养猪业由过去的家庭式饲养模式逐步向规模化发展，但由于饲养规模大、饲养密度高、应激因素多，加上中国独特的生态、地理、气候条件和人们的生活习惯，使得候鸟、水禽、猪、人频繁接触并交叉循环感染，极易引起SI等群发性疾病的反复流行。因此，了解SI在中国流行情况及开展SIV流行病学的研究，不仅可促进中国畜牧业的健康稳定发展，满足疫病防制的需要，也将为流感的预测预报及防制对策的制定提供根本立足点和理论依据。因此，快速、特异、敏感、便于操作的诊断和检测方法的使用，将为有效预防和控制猪流感的发生提供有力的手段和重要的工具。
2.研制历程
2006年，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室采用分子生物学技术表达了猪流感病毒（H1亚型）的HA蛋白，从而为试剂盒的开发打下了基础。
2007年，公司与华中农业大学联合对猪流感病毒（H1亚型）ELISA抗体检测试剂盒进行了中间试制研究。
2008年，两家单位对试剂盒的敏感性，特异性及相关生产工艺做了进一步优化。
2011年，申报并完成了临床试验。
2013年，武汉科前动物生物制品有限责任公司等三家单位联合申报了该试剂盒的新兽药注册证书。经过不断改进和完善，于2013年1月获得了农业部的批准，证号【（2013）新兽药证字5号】。
二、新兽药名称及主要组分
通用名：猪流感病毒（H1亚型） ELISA抗体检测试剂盒
主要组分：本试剂盒系用猪流感病毒H1亚型血凝素（HA）基因的原核表达产物作为包被抗原，由抗原包被板、血清稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪酶标二抗、样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗涤液等组成。
三、试剂盒的创新点和特点
猪流感病毒（H1亚型）ELSIA抗体诊断试剂盒为国内首创，拥有自主知识产权；该试剂盒具有简便、快速、灵敏等特点，适合基层实验室技术人员使用；可用于检测猪流感病毒（H1亚型）的抗体，有利于猪场对该病的控制；试剂盒重复性好，批间变异系数小，特异性良好，敏感性高。
四、检测原理
流感病毒亚型分类的关键是HA基因，以猪流感病毒（HA）基因的原核表达产物作为包被抗原，可以特异性检测猪血清中的流感病毒H1亚型的抗体水平。
五、试剂盒质量的相关试验
1.特异性试验
使用试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪萎缩性鼻炎、猪胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌、猪口蹄疫、猪瘟、猪弓形虫、猪水疱性口炎、猪衣原体、猪流感病毒H3亚型、猪流感病毒H9亚型、猪流感病毒H1亚型13种病原的阳性参考血清，结果显示非猪流感病毒H1亚型血清OD630nm值均低于阳性判定标准，判为阴性，而猪流感病毒H1亚型阳性参考血清则为阳性(见表1)；试剂盒对来自未免疫猪流感病毒H1亚型疫苗的猪血清30份进行ELISA检测，结果均为阴性。说明猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒的特异性良好，不但与我国主要病毒性和细菌性疾病的阳性参考血清无交叉反应，而且与其它亚型的猪流感阳性参考血清反应也有较好的特异性。
表1 三批猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒检测13种病原的阳性血清结果
阳性血清
猪繁殖与呼吸综合征
猪伪狂犬病
猪萎缩性鼻炎
猪胸膜肺炎
副猪嗜血杆菌
猪口蹄疫
猪瘟
猪弓形虫
猪水疱性口炎
猪衣原体
猪流感病毒H3亚型
猪流感病毒H9亚型
猪流感病毒H1亚型
阳性对照
阴性对照
OD值
0.057
0.139
0.090
0.108
0.93
0.139
0.111
0.123
0.150
0.132
0.087
0.094
1.416
1.204
0.082
2.敏感性试验
选择OIE认可的检测流感病毒抗体方法―HI试验与该试剂盒比较来确定该试剂盒的敏感性。该试剂盒与HI试验相比较，敏感性为96.9%,具体结果见表2。
表2 54份血清检测结果
血清编号
ELISA试剂盒效价
HI效价
血清编号
ELISA试剂盒效价
HI效价
1
1.575
8 log2
28
0.659
5 log2
2
0.958
6 log2
29
0.269
3log2
3
0.899
5 log2
30
1.578
8 log2
4
1.263
7 log2
31
1.077
7 log2
5
1.560
6 log2
32
1.458
9 log2
6
1.721
7 log2
33
1.315
7 log2
7
1.658
8 log2
34
1.143
7 log2
8
1.445
6 log2
35
1.050
7 log2
9
1.699
8 log2
36
0.692
5 log2
10
1.655
8 log2
37
1.056
8 log2
11
0.405
2 log2
38
1.011
7 log2
12
1.256
7 log2
39
0.342
0 log2
13
1.459
6 log2
40
1.197
8 log2
14
1.554
7 log2
41
0.503
5 log2
15
1.399
6 log2
42
0.777
8 log2
16
0.562
5 log2
43
1.312
8 log2
17
0.786
5 log2
44
1.057
8 log2
18
1.250
6 log2
45
1.312
8 log2
19
1.479
7 log2
46
0.376
0 log2
20
1.457
7 log2
47
1.857
9 log2
21
0.894
6 log2
48
1.163
6 log2
22
0.564
5 log2
49
1.084
5 log2
23
0.897
6 log2
50
0.867
5 log2
24
1.248
6 log2
51
0.285
0 log2
25
1.364
7 log2
52
1.186
6 log2
26
0.751
5 log2
53
1.343
8 log2
27
0.174
0 log2
54
1.521
8 log2
阳性
对照
1.181
7 log2
阴性对照
0.087
0 log2
抽取的10份阳性血清经倍比稀释至1:1280，用试剂盒检测其最低检出量，结果显示该试剂盒可以检测到1:640倍稀释的阳性血清（表3）。
表3 10份阳性血清结果
血清编号
稀释倍数
血清ELISA
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
1:1280
效价
1
1.011
0.858
0.724
0.655
0.425
0.254
1:640
2
0.945
0.872
0.745
0.625
0.486
0.174
1:640
3
0.977
0.690
0.557
0.465
0.388
0.211
1:640
4
0.911
0.721
0.611
0.367
0.209
0.126
1:320
5
1.322
1.113
0.844
0.634
0.405
0.216
1:640
6
0.789
0.645
0.401
0.260
0.167
0.134
1:160
7
1.244
1.023
0.844
0.634
0.422
0.225
1:640
8
1.132
0.901
0.774
0.651
0.431
0.239
1:640
9
1.097
0.777
0.547
0.445
0.375
0.155
1:640
10
1.202
0.911
0.749
0.666
0.445
0.221
1:640
六、临床应用
用实验室试制的猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒和IDEXX®猪流感H1N1抗体检测试剂盒对来自湖北、湖南、山东、河南、河北、安徽、江西、福建、广东、广西等地273份有明显呼吸道症状的临床血清样品进行检测，两者阳性符合率为97.03%（131/135），阴性符合率为97.18%（138/142），总符合率为82.41%（225/273）(表4中IDEXX®公司猪流感H1N1抗体检测试剂盒简写为IDEXX，实验室试制的猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒简写为HZAU。具体结果见表4、表5)。
表4-1两种试剂盒检测结果（血清编号1-94）
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清
编号
IDEXX
HZAU
1
0.269
0.282
25
0.441
0.476
49
0.051
0.137
73
0.066
0.219
2
0.163
0.179
26
0.278
0.699
50
0.073
0.689
74
0.087
0.229
3
0.071
0.171
27
0.358
0.597
51
0.097
0.55
75
0.072
0.379
4
0.293
0.139
28
0.115
0.502
52
0.063
0.226
76
0.066
0.329
5
0.274
0.218
29
0.258
0.202
53
0.282
0.229
77
0.059
0.225
6
0.061
0.162
30
0.179
0.183
54
0.279
0.579
78
0.044
0.275
7
0.172
0.216
31
0.149
0.437
55
0.251
0.732
79
0.035
0.085
8
0.251
0.618
32
0.069
0.818
56
0.281
0.483
80
0.068
0.11
9
0.071
0.14
33
0.349
0.367
57
0.153
0.311
81
0.051
0.112
10
0.172
0.541
34
0.053
0.370
58
0.277
0.785
82
0.090
0.099
11
0.316
0.302
35
0.448
0.224
59
0.308
0.915
83
0.048
0.111
12
0.071
0.293
36
0.126
0.186
60
0.133
0.534
84
0.043
0.078
13
0.131
0.254
37
0.422
0.632
61
0.187
0.842
85
0.046
0.114
14
0.315
0.596
38
0.283
0.356
62
0.256
0.778
86
0.045
0.112
15
0.312
0.96
39
0.076
0.282
63
0.263
0.456
87
0.080
0.064
16
0.109
0.214
40
0.059
0.485
64
0.317
0.562
88
0.047
0.071
17
0.107
0.428
41
0.068
0.487
65
0.047
0.443
89
0.057
0.112
18
0.389
0.599
42
0.066
0.198
66
0.116
0.653
90
0.054
0.11
19
0.046
0.474
43
0.143
0.204
67
0.065
0.183
91
0.227
0.203
20
0.331
0.441
44
0.051
0.172
68
0.139
0.269
阳性对照
0.540
1.214
21
0.423
0.393
45
0.081
0.143
69
0.262
0.48
阳性对照
0.570
1.212
22
0.258
0.89
46
0.325
0.224
70
0.065
0.511
阴性对照
0.098
0.101
23
0.257
0.652
47
0.257
0.441
71
0.093
0.492
阴性对照
0.075
0.102
24
0.368
0.831
48
0.062
0.163
72
0.073
0.573
空白对照
;
;
注：IDEXX试剂盒S/P值＞0.4为阳性，S/P值＜0.4判为阴性；HZAU试剂盒S≥0.305判为阳性，S＜0.305判为阴性（S：样品孔OD630nm值，P：阳性对照孔平均OD630nm值）。
表4-2两种试剂盒检测结果（血清编号92-182）
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清
编号
IDEXX
HZAU
92
0.075
0.147
116
0.786
1.056
140
0.196
0.297
164
0.063
0.334
93
0.158
0.222
117
0.485
1.011
141
0.774
0.232
165
0.051
0.131
94
0.06
0.135
118
0.621
0.542
142
0.293
1.354
166
0.591
0.981
95
0.069
0.16
119
0.698
1.197
143
0.536
0.582
167
0.069
0.122
96
0.083
0.151
120
0.425
0.53
144
0.336
0.878
168
0.062
0.216
97
0.089
0.126
121
0.653
0.462
145
0.542
0.414
169
0.084
0.292
98
0.088
0.173
122
0.579
0.66
146
0.321
0.544
170
0.088
0.156
99
0.068
0.182
123
0.575
0.737
147
0.683
0.696
171
0.091
0.23
100
0.067
0.144
124
0.646
0.654
148
0.65
0.876
172
0.426
1.179
101
0.085
0.154
125
0.547
1.419
149
0.648
0.821
173
0.071
0.257
102
0.069
0.132
126
0.133
0.052
150
0.06
0.23
174
0.081
0.2
103
0.097
0.282
127
0.557
0.268
151
0.045
0.247
175
0.054
0.162
104
0.135
0.143
128
0.333
0.634
152
0.531
0.842
176
0.106
0.182
105
0.141
0.185
129
0.417
0.815
153
0.383
1.071
177
0.157
0.138
106
0.056
0.142
130
0.625
0.407
154
0.091
0.209
178
0.268
0.187
107
0.194
0.226
131
0.052
0.593
155
0.338
0.349
179
0.073
0.284
108
0.058
0.134
132
0.407
0.805
156
0.056
0.114
180
0.087
0.222
109
0.609
0.78
133
0.439
0.317
157
0.606
0.755
181
0.258
0.251
110
0.517
1.312
134
0.589
0.616
158
0.344
0.383
182
0.128
0.129
111
0.615
1.057
135
0.632
1.163
159
0.271
0.785
阳性对照
0.541
1.216
112
0.72
1.312
136
0.492
1.084
160
0.402
0.174
阳性对照
0.551
1.214
113
0.297
0.929
137
0.295
0.867
161
0.257
0.239
阴性对照
0.075
0.105
114
0.626
0.489
138
0.13
0.285
162
0.192
0.162
阴性对照
0.087
0.107
115
0.491
0.406
139
0.57
1.043
163
0.533
0.415
空白对照
;
;
注：IDEXX试剂盒S/P值＞0.4为阳性，S/P值＜0.4判为阴性；HZAU试剂盒S≥0.303判为阳性，S＜0.303判为阴性（S：样品孔OD630nm值，P：阳性对照孔平均OD630nm值）。
表4-3两种试剂盒检测结果（血清编号183-273）
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清编号
IDEXX
HZAU
血清
编号
IDEXX
HZAU
183
0.085
0.162
207
0.317
1.492
231
0.311
0.15
255
0.076
0.121
184
0.096
0.171
208
0.509
0.96
232
0.254
1.082
256
0.108
0.099
185
0.065
0.217
209
0.364
0.532
233
0.311
1.165
257
0.043
0.096
186
0.709
1.305
210
0.275
0.315
234
0.287
0.114
258
0.046
0.227
187
0.304
0.556
211
0.354
0.399
235
0.385
1.184
259
0.043
0.085
188
0.257
0.123
212
0.267
0.324
236
0.26
0.163
260
0.044
0.098
189
0.363
0.271
213
0.387
1.199
237
0.448
0.188
261
0.039
0.075
190
0.446
0.708
214
0.391
0.334
238
0.046
0.159
262
0.039
0.084
191
0.339
1.056
215
0.301
0.147
239
0.347
0.775
263
0.062
0.108
192
0.331
1.152
216
0.555
0.845
240
0.129
0.22
264
0.056
0.083
193
0.388
0.999
217
0.301
0.447
241
0.063
0.191
265
0.056
0.141
194
0.489
0.434
218
0.484
0.853
242
0.077
0.17
266
0.038
0.106
195
0.574
0.998
219
0.469
0.685
243
0.293
0.192
267
0.126
0.11
196
0.06
0.254
220
0.432
0.785
244
0.060
0.262
268
0.071
0.232
197
0.052
0.226
221
0.476
0.342
245
0.070
0.140
269
0.049
0.181
198
0.118
0.252
222
0.304
0.52
246
0.153
0.146
270
0.043
0.169
199
0.379
0.454
223
0.157
0.656
247
0.067
0.074
271
0.021
0.057
200
0.292
0.284
224
0.443
0.645
248
0.126
0.061
272
0.058
0.093
201
0.283
0.337
225
0.527
1.378
249
0.061
0.149
273
0.063
0.119
202
0.489
0.328
226
0.285
0.440
250
0.046
0.096
阳性对照
0.540
1.215
203
0.299
1.014
227
0.066
0.258
251
0.076
0.15
阳性对照
0.570
1.215
204
0.308
1.228
228
0.272
0.603
252
0.047
0.161
阴性对照
0.050
0.128
205
0.136
0.875
229
0.298
0.749
253
0.054
0.119
阴性对照
0.050
0.122
206
0.416
1.396
230
0.399
0.379
254
0.073
0.149
空白对照
;
;
注：IDEXX试剂盒S/P值＞0.4为阳性，S/P值＜0.4判为阴性；HZAU试剂盒S≥0.304判为阳性，S＜0.304判为阴性（S：样品孔OD630nm值，P：阳性对照孔平均OD630nm值）。
表5 猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒与IDEXX®猪流感H1N1抗体检测试剂盒之间的比较
检测类型
猪流感病毒H1亚型ELISA抗体检测试剂盒
阳性
阴性
合计
IDEXX®猪流感H1N1抗体检测试剂盒
阳性
109
22
131
阴性
26
116
142
合计
135
138
273
联系方式：027-87284425
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