兰花细菌性褐腐病菌（Erwinia cypripedii）为肠杆菌科欧文氏菌属的植物病原细菌，主要分布于南非、日本、澳大利亚、美国及我国台湾，可通过植株进行远距离传播，严重危害兰科植物引起褐腐病，一般侵染兰科植物肉质叶片，开始为小水浸状斑，然后扩展并微凹陷，淡褐色油浸状，并扩展到茎和生长点，是危害兰花的一种很重要的细菌病害。目前在我国大陆境内尚未发现有兰花细菌性褐腐病菌的研究报道。山东青岛口岸在从韩国进境的大花蕙兰(Cymbidium)植株中发现叶片中部有卵圆形、油浸状的褐色或黑色斑点，轮廓清晰、中间略凹陷，较符合兰花细菌性褐腐病菌致病特征。为此，笔者对病斑进行了病菌分离，并通过形态特征、培养特征、生理生化、致病性测定及16S rDNA序列分析对其进行了鉴定，旨在为我国兰花细菌性褐腐病菌的预防及控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料。从韩国进口的大花蕙兰鲜活叶片。

1.1.2 仪器与试剂。BIOLOG全自动微生物鉴定仪，美国BIOLOG公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；革兰氏染色试剂盒，北京路桥公司。

1.2方法

1.2.1病菌的分离和纯培养。采用平板划线分离法。挑取有卵圆形、油浸状的褐色斑点的叶片材料，用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭表面，晾干后切取病健交界部位组织置于培养皿内，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿上，加几滴无菌水，用无菌解剖刀将其切碎，用接种针蘸取悬液划线于NA平板上，28℃培养箱中培养48 h，挑取出2种形态的优势单菌落，编号分别为l号、2号菌株，并进行纯化。

1.2.2致病性测定。供试蝴蝶兰为感病品种。将纯化的1号、2号菌株分别在NA平板上28℃培养24h后。用无菌水配成10m cfu/ml的菌悬液，针刺接种到6月生蝴蝶兰(3-4叶期)叶片基部，以清水作对照，置于植物生长培养箱内，温度为28℃，相对湿度为80%，光照12 h，每24h观察一次发病情况。取发病明显的蝴蝶兰幼苗叶片，按照“1.2.1”的方法重新分离病原菌。对柯赫法则验证确认的菌株进行鉴定。

1.2.3病原菌鉴定。

1.2.3.1 形态特征观察。将菌株接种到NA培养基上，28℃培养24h后进行菌落培养特征观察、革兰氏染色、菌体特征观察等。

1.2.3.2 生理生化指标测定。参照任欣正的方法进行菌株的生理生化指标测定，采用Biolog全自动微生物鉴定仪进一步测定分离菌株对95种不同碳源的利用情况。

1.2.3.3 16S rDNA基因序列分析。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌基因组DNA，用细菌16S通用引物PF:5’-AGAGTITGATCATGGCTCAG-Y和5’-ACGGTrACCTr-GTFACGACTI'-3’进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5斗l，dNTP( 2.5 mmol/L) 1.0，TaqDNA酶(5 U／¨I)0.2¨l，正、反向引物(5 mmol/L)各1.0μl，DNA模板1.0μ1，双蒸水补足至25.0μl。PCR扩增程序：94℃预变性2 min；94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10 rain。扩增产物经纯化后由江苏南京金思瑞生物技术有限公司测序，测序为双向引物测序，引物为PF和PR。将测得的基因序列与GenBank中核酸数据库进行序列比对分析。

2结果与分析

2.1 病原细菌的致病性测定 分离得到的1号菌株对蝴蝶兰幼苗有较强的致病性，针刺接种后24h接种点出现水浸状斑点，72 h后扩展并联合成片，微凹陷，淡褐色油浸状，外围具浅绿色的晕圈，随着病情的进一步扩展，叶片表现为大面积的褐色腐烂症状。危害症状与报道的兰花细菌性褐腐病菌症状一致。从蝴蝶兰接种病变叶片中又唯一分离到与1号菌形态一致的病原菌；2号菌株接种及对照组均未出现叶A片发病，经柯赫法则验证，确认分离的l号菌株为导致大花蕙兰植株病变的病原细菌。

2.2病原菌的鉴定

2.2.1 培养特征。病原菌在NA培养基上单菌落表现为淡黄色、圆形、表面突起、边缘整齐，光滑不透明。

2.2.2 菌体特征及生理生化特性。病原菌菌体杆状，两端钝圆，大小为(0.5 - 1.0)lxm×(1.0 N3.0)μm，周生鞭毛，为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，最适生长温度为27 - 30℃，37℃能生长，氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性，能利用海藻糖、麦芽糖、蜜二糖和纤维二糖，不能从乳糖、棉子糖产酸，不能液化明胶，不产生吲哚，不产3．羟基丁酮。

Biolog全自动鉴定仪碳源分析结果表明，病原菌与标准菌株的相似值( SIM)为0.791，可能性值(PROB)为100，仪器分析鉴定结果为Erwinia cypripedii。

2.2.3 16S rDNA序列测定及Blast比对结果。以病原菌的基因组DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增，获得一条1.4kb左右的特异性片段。扩增产物经过纯化后进行测序，将序列与GenBank中序列进行Blast比对分析，结果表明，该序列与E．c)7)ripedii( GenBank：FJ823047.1)相似性最高，达到99%。

3 结论与讨论

通过危害症状、形态鉴定、培养特征、生理生化及16SrDNA序列分析和致病性测定，可以确认从韩国进境的大花蕙兰上分离的病原细菌为兰花细菌性褐腐病菌（E．c3pripe-dii）。

大花蕙兰为兰科兰属多年生草本植物，又叫虎头兰，是兰属中一部分附生性种类的杂交种‘3]。白1889年英国培育出第1个大花蕙兰品种以后，在20世纪40年代欧美也选育出大量种间和品种间杂种。至今，大花蕙兰的栽培品种已有近2万个，在国内外市场十分走俏，成为兰花中的庞大品种群。目前已报道的兰花细菌性褐腐病菌寄主有仙人指甲兰（Aeridi.~ japonium）、杓兰属（Cypripedium spp．）、兜兰属（Paphiopedilum）、蝶兰属（Phalaenopsis）和番木瓜（Cagica pa-paya），该次研究从大花蕙兰中检出该病菌，说明该病菌对兰属也具有致病性。

世界主要贸易国家对兰花上的细菌病害检疫要求严格程度不一，马来西亚将兰花细菌性褐腐病菌列为检疫性植物有害生物。我国仅将兰花细菌性褐斑病菌（Acidovorax ave-nae subsp．cattleyae）和菊基腐病菌（Erwinia chrysanthemi）列为进境兰花的植物检疫性有害生物，上述2种检疫性植物病原细菌在我国已有分布和危害的报道，我国大陆境内尚没有兰花细菌性褐腐病菌分布且关于该病菌分离鉴定与特性的研究报道。但是，随着贸易的发展，近年来我国引进兰花的品种和数量大幅度增加，新病害传人的风险日益增大，所以加强进境兰花中细菌病害的检疫成为防止细菌病害蔓延的有效措施。加强兰花检疫监管，加强实验室快速检测方法的研究，对于控制病害的传播蔓延、保证我国兰花贸易具有重要意义。

厉艳，王英超，尼秀媚，甘琴华，封立平 （山东出入境检验检疫局，山东青岛266001）

安徽农业科学，2012，40(31):15243 - 14244

马桂莲、张琴采集；俞美莲、姚佳编译；姚利根、姚佳编辑上传；江洪涛审核。

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