饲料维生素A测定高效液相色谱法标准 -行业标准--中国农资供销网

饲料维生素A测定高效液相色谱法标准

时间：2009-11-20 11:25:26来源：作者：成龙

　　标准类别：GB-国家标准，关键词：饲料维生素A测定高效液相色谱法，标准号：GB/T17817-1999，标准名称：饲料中维生素A的测定高效液相色谱法，标准分类：农业饲料标准。
1 范围
本标准规定了饲料中维生素 A的测定———高效液相色谱法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生素预混料中维生素 A的测定。测量范围为每千克样品中含维生素A在1000IU以上。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法
3 方法原理
用碱溶液皂化试验样品，乙醚提取未皂化的化合物，蒸发乙醚并将残渣溶解于正己烷中，将正己烷提取物注入用硅胶填充的高效液相色谱柱，用紫外检测器测定，外标法计算维生素A含量。
4 试剂和材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中用水规定。
4.1 无水乙醚（无过氧化物）。
4.1.1过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。若加0.5%淀粉指示液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
4.1.2去除过氧化物的方法：乙醚用 5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
4.2 乙醇。
4.3 正己烷：重蒸馏（或光谱纯）。
4.4 异丙醇：重蒸馏。
4.5 甲醇：优级纯。
4.6 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）。
4.7 无水硫酸钠。
4.8 氢氧化钾溶液500g/L。
4.9 抗坏血酸乙醇溶液5g/L：取0.5g抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的蒸馏水中，用乙醇稀释至100mL，临用前配制。
4.10 维生素A标准溶液
4.10.1 维生素A标准贮备液：准确称取维生素A乙酸酯油剂（每克含1.00×10的6次方IU）0.1000g或结晶纯品0.0344g（符合中国药典）于皂化瓶中，按分析步骤（7.1）皂化和提取，将乙醚提取液全部浓缩蒸发至干，用正己烷溶解残渣置入100mL棕色容量瓶中并稀释至刻度，混匀，4℃保存。该贮备液浓度为每毫升含1000IU维生素A。
4.10.2维生素A标准工作液：准确吸取1.00mL维生素 A标准贮备液（4.10.1），用正己烷（4.3）稀释100倍；若用反相色谱测定，将1.00mL维生素 A标准贮备液置入10mL棕色小容量瓶中，用氮气吹干，用甲醇（4.5）溶解并稀释至刻度，混匀，再按1∶10比例稀释。该标准工作液浓度为每毫升含10IU维生素A。
4.11 酚酞指示剂乙醇溶液10g/L。
4.12 氮气99.9%。
5 仪器、设备
5.1 实验室常用仪器、设备。
5.2 圆底烧瓶，带回流冷凝器。
5.3 恒温水浴或电热套。
5.4 旋转蒸发器。
5.5 超纯水器（或全磨口玻璃蒸馏器）。
5.6 高效液相色谱仪，带紫外检测器。
6 试样的制备
选取有代表性的饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
7 分析步骤
7.1 试验溶液的制备
7.1.1皂化
称取配合饲料或浓缩饲料10g，精确至0.001g。维生素预混料或复合预混料1-5g，精确至0.0001g。置入250mL圆底烧瓶中，加50mL抗坏血酸乙醇溶液（4.9），使试样完全分散、浸湿，加10mL氢氧化钾溶液（4.8），混匀。置于沸水浴上回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL乙醇、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃。
7.1.2提取
定量转移全部皂化液于盛有100mL乙醚（4.1）的500mL分液漏斗中，用30-50mL蒸馏水分2-3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡2min，静置分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100、60mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用蒸馏水每次100mL洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠（4.7）脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mgBHT（4.6）使之溶解，用乙醚定容至刻度（Vex）。以上操作均在避光通风柜内进行。
7.1.3 浓缩
从乙醚提取液（Vex）中分取一定体积（Vri）（依据样品标示量，称样量和提取液量
确定分取量），置于旋转蒸发器烧瓶中，在水浴温度约50℃，部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干，残渣用正己烷溶解（反相色谱用甲醇溶解），并稀释至10mL（Ven），使其维生素A最后浓度为每毫升5-10IU，离心或通过0.45%m过滤膜过滤，收集清液移入2mL小试管中，用于高效液相色谱仪分析。
7.2 测定
7.2.1高效液相色谱条件
7.2.1.1正相色谱
柱长：12.5cm，内径4mm不锈钢柱。
固定相：硅胶Lichrosorbsi60，粒度5μm。
移动相：正己烷十异丙醇（98 2），恒量流动。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长326nm。
保留时间：3.75min
7.2.1.2反相色谱
柱长：12. 5cm，内径4mm不锈钢柱。
固定相：ODS（或 C18），粒度5μm。
移动相：甲醇水（95 5）。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长326nm。
保留时间：4.57min。
7.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（AUFS），色谱峰分离度符合要求（ R≥1.5）（中国药典 1995附录）。向色谱柱注入相应的维生素A标准工作液（4.10.2 Vst）和试验溶液（7.1.3Vi），得到色谱峰面积的响应值（Pst、Pi），用外标法定量测定。
8 结果的计算与表述
8.1 计算公式：结果按式（1）计算：
Pi×Vex×Ven×ρi×Vst
ωA= ……………………………（1）
Pst×m×Vri×Vi×fi
式中：ωA ———每克或每千克样品中含维生素 A的量，IU；
m———样品质量，g；
Vex———提取液的总体积，mL；
Vri———从提取液（V ex）中分取的溶液体积，mL；
Ven一—试验溶液最终体积，mL；
ρi———标准溶液浓度，μg/mL；
Vst———维生素A标准溶液进样体积，μL；
Vi———从试验溶液中分取的进样体积，μL；
Pst———与标准工作液进样体积（Vst）相应的峰面积响应值；
Pi—一与从试验溶液中分取的进样体积（Vi）相应的峰面积响应值；
fi———转换系数，1国际单位相当于0.344%g维生素A乙酸酯，或0.300%g视黄
醇活性。
8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。
9 允许差
同一分析者对同一试样同时两次测定（或重复测定）所得结果相对偏差：
每千克试样中含维生素A的量，IU 相对偏差，%
1.00×M-1.00×N ±20
>1.00×N-1.00×Y ±15
>1.00×Y-1.00×T ±10
>1.00×T ± 5

注：M=10的3次方；N=10的4次方；Y=10的5次方；T=10的6次方