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饲料细菌总数测定方法标准

时间：2009-11-20 13:53:24来源：作者：成龙

　　标准类别：GB-国家标准，关键词：饲料细菌总数测定方法，标准号：GB13093-91，标准名称：饲料中细菌总数的测定方法，标准分类：农业饲料标准。
本标准参照采用国际标准 ISO4833—1978《食品和动物饲料中微生物学检验方法》。
1 主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中细菌总数的测定方法。
本标准适用于饲料中细菌总数的测定。
2 原理
将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在30±1℃下培养72±3h，计数平板中长出的菌落数，计算每克试样中的细菌数量。
3 仪器、设备
3.1 天平：感量为0.1g。
3.2 振荡器：往复式。
3.3 干热灭菌箱：50-200±1℃。
3.4 高压灭菌锅。
3.5 冰箱：普通冰箱。
3.6 恒温箱30±51℃ 。
3.7 电炉：可调式。
3.8 平皿：直径为9cm。
3.9 吸管：容量为1、10mL。
3.10 三角烧瓶：容量为 250、500mL。
3.11 玻璃珠。
3.12 试管：18×180mm。
3.13 水浴锅46±1℃。
3.14 酒精灯。
3.15 试管架。
3.16 橡皮乳头。
4 检验程序
细菌总数的检验程序如下：

检样
↓
做成几个适当倍数的稀释液
↓
选择2-3个适宜稀释度，各以1ml量加入灭菌皿内
↓
每平皿内加入适量琼脂
30±1℃ ↓ 72±3h
菌落计数
↓
报告
5 操作步骤
5.1 采样
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混合。
海运进口饲料采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛饲料超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。
5.2 试样稀释及培养
5.2.1无菌称取试样10.0g，放入含有 90mL稀释液的灭菌三角烧瓶内（瓶内领先加有
适当数量的玻璃珠）。经充分振摇，制1∶10的均匀稀释液。最好置振荡器中以8000-
10000r/min的速度处理2-3min。
5.2.2用1mL灭菌吸管吸取 1∶10稀释液 1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，作成 1∶100的稀释液。
5.2.3另取一支1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支吸管。
5.2.4根据饲料卫生标准要求或对试样污染程度的估计，选择2 3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
5.2.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46±1℃的平板计数用培养基（可放置46±1℃水浴锅内保温）注入平皿约15mL，小心转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过 15min。
5.2.6待琼脂凝固后，倒置平皿于30±1℃ 恒温箱内培养72±3h取出，计数平板内菌落数目，菌落数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。
5.3 菌落计数方法
作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助于放大镜检查，以防遗漏。在计数出各平板菌落数后，求出同一稀释度两个平板菌落的平均数。
6 菌落计数的报告
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 2以代表全平板菌落数。
6.1 稀释度的选择
6.1.1应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
6.1.2如有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，视两者之比如何来决定，如其比值小于2，应报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字。
6.1.3如所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀
释倍数报告之。
6.1.4如所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀
释倍数报告之。
6.1.5如所有稀释度均无菌落生长，则以小于（ <）1乘以最低稀释倍数报告之。
6.1.6如所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30
时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
6.2 结果报告
菌落在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。
附录 A
稀释液和培养基制备
（补充件）
除特殊规定外，本标准所用化学试剂为分析纯，生物制剂为细菌培养用；水为蒸馏
水或无离子水。要求在试验条件下，所用试剂应无抑制细菌生长的物质存在。
A1 稀释液
A1.1 成分
氯化钠（GBl266） 8.5g
蛋白胨 1.0g
蒸馏水 1000mL
A1.2 制法
将上述成分加热溶解，校正 pH使其在灭菌后保持7.0±2。按9mL/支分装于试管，90mL/瓶分装于三角烧瓶中，塞上棉塞包扎后121±1℃高压灭菌 20min。
A2 平板计数用培养基
A2.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 2.5g
无水 D-葡萄糖 1.0g
琼脂 9-18g
蒸馏水 1000mL
A2.2 制法
将上述成分加热溶化，校正 pH使其在灭菌后保持7.0±2。过滤、分装三角烧瓶中，包扎后121±1℃高压灭菌 20min。
A3 水琼脂培养基
A3.1 成分
琼脂 9-18g
蒸馏水 1000mL
A3.2 制法
加热使琼脂溶化，校正 pH使其在灭菌后保持7.0±2。分装三角烧瓶中，包扎后121±1℃高压灭菌 20min。
上述稀释液和培养基如不马上使用，应保存在0-5℃下，时间不超过一个月。