1范围
本标准规定了固氮菌肥料的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存等。
本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气,供作物氮素营养,又能分泌激素剌激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T625一1989化学试剂硫酸
GB/T629一1997化学试剂氢氧化钠
GB/T1250一1989极限数值的表示方法和判定方法
GB/T6543一1986瓦愣纸箱
GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法
3定义
本标准采用下列定义：
3.1自生固氮菌
在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。
3.2根际联合固氮菌
既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。
3.3固氮效能
固氮菌每消耗1g碳水化合物（糖）从空气中摄取氮素的毫克数，固氮效能用mg氮/g糖表示。
4产品分类
4.1按形态不同，分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。
4.2按菌种及特性分为：自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。
5技术要求
5.1菌种
在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。
5.1.1自生固氮菌
用固氮菌属（Azotobacter）、氮单胞菌属（Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（Azorhizobium）和固氮芽孢杆菌（Paenibacillusazotofixans）的菌株。
5.1.2根际联合固氮菌
可用下列菌种：固氮螺菌（Azospirillum）；阴沟肠杆菌（Enteroba）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（Klebseillapneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。
使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合5.1要求。
生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。
5.2成品技术指标(见表1)
表1成品技术指标
项目
液体
固体
冻干
外观、气味
乳白或淡褐色液体，浑浊，稍有沉淀，无异臭味
黑褐色或褐色粉状，湿润、松散，无异臭味
乳白色结晶，无味
水分，%
-
25.0~35.0
3.0
pH值
5.5~7.0
6.0~7.5
6.0~7.5
细度，过孔径0.18mm标准筛的筛余物，%≤
2
20.0
-
有效活菌数，个/ml
(个/g、个/瓶)≥
5.0×108
1.0×108
5.0×108
杂菌率1），%≤
5.0
15.0
2.0
有效期2），月≥
3
6
12
1）其中包括10-6马丁培养基平板上无霉菌。
2）此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。
6抽样
按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。
6.1抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。
6.2抽样数量及抽样方法
在成品库抽样，按“”形分层设点抽样，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30-50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件，全部抽样。11-200件，抽样10件；201-400件，抽取20件。样品基数大于400件，按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。
每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。
液体产品每件吸取10mL，一同防入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支防入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每份50mL。贴上抽样标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。
7检验方法
7.1仪器设备及试剂
7.1.1仪器设备
生物显微镜（10×100）；
菌落计数器；
恒温培养箱；
恒温干燥箱；
恒温摇床；
灭菌锅；
无菌室或超净工作台；
酸度计；
试管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm；
培养皿：直径9cm；
三角瓶：500mL；
无菌吸管：1、2、5、10mL；
玻璃刮刀；
滤纸；
酒精灯；
标准筛：孔径0.18mm和0.15mm；
1号羊毛画笔；
无菌水；
无离子水。
7.1.2试剂
选择培养基（附录A）；
刚果红染液（0.5%）。
7.2成品检验
7.2.1气味检验
取固氮菌肥料样品打开包装，进行感官检验。
7.2.2外观检验
将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感官检验。
7.2.3pH值测定
液体固氮菌肥料的pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。
固体固氮菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。
7.2.4含水量测定
称取固体固氮菌肥料三份，每份20.00g，精确到0.01g，放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。
含水量(%)=（m0-m1）/m0×100…………(1)
式中：m0一烘干前样品质量，g
m1一烘干后样品质量，g。
7.2.5吸附剂颗粒细度测定
称样10.00g(精确至0.01g)，置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm)，用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105~110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式(2)计算：
筛余物(%)=筛余物质量/（1-样品含水量百分数）/样品质量×100………(2)
7.2.6有效活菌数及杂菌率的测定
采用平板计数法测定固氮菌活菌数及杂菌率。
采样应不少于500g，从中抽取10.00g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0mL加入90mL的无菌水中)，静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液的菌悬液。
用无菌吸管分别吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成1：10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×102，1：1×103，1：1×104，1：1×105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
用0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28℃培养2~3d后每个稀释度取5~10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30~300个之间的平板），计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。
杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他种菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。
7.2.6.2允许差
平行样品误差按式（3）计算，并应符合表2的规定。
………(3)
表2平板上菌落数对应的单一标准差
7.2.6.3测定结果的计算
按式（4）、式（5）计算样品的有效活菌数及杂菌率
有效活菌数（个/g）=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积/菌剂克数或毫升数/加样量…………(4)
杂菌率(%)=杂菌总数/（固氮菌数 杂菌总数）×100………(5)
7.2.7有效期检验
在产品说明书标明的有效期到达前10d测定成品各项指标，方法同7.2.1~7.2.6。
8检验规则
8.1检验分类
8.1.1产品出厂检验
产品交货时进行的检验。
8.1.2产品型式检验
新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。
8.2检验项目
型式检验的检验项目按5.2要求进行。出厂检验不检有效期。
8.3判定规则
8.3.1合格产品:
a)检验结果符合5.2所规定的技术指标的产品为合格产品；
b)产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30×10-5，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；
c)产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。
8.3.2不合格产品:
a)产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；
b)产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），判为不合格品；
c)产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合，判为不合格产品；
d)产品检验在马丁培养基平板上霉菌数≥30×10-5，判为不合格产品；
e)产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中，有4项不符合技术指标，判为不合格产品。
8.3.3含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。
8.3.4本标准中质量指标合格判断，采用GB/T1250中修约值比较。
9包装、标识、运输和贮存
9.1包装
9.1.1内包装
液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。
9.1.2外包装
外包装采用纸箱，纸箱质量应符合GB/T6543要求。箱外用尼龙打包带加固。
9.1.3每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。
9.2标识
在包装箱(袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。
9.3运输
适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及35℃以上高温。气温低于0℃时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。
9.4贮存
产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为10℃~25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35℃以上高温。
附录A
(标准的附录)
有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基
A1、固氮菌用阿须贝（Ashby）培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g
硫酸镁（MgSO4?7H2O）0.2g
氯化纳(NaCl)0.2g
碳酸钙(CaC03)5.0g
甘露醇（C6H14O6）10.0g
硫酸钙(CaS04?7H2O)0.lg
pH值7.0
A2、固氮（茎瘤）根瘤菌培养基
乳酸钠（C3H5O3Na）10.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.67g
磷酸二氢钾（KH2PO4）0.87g
氯化纳(NaCl)0.05g
氯化钙(CaCl2)0.04g
氯化铁(FeCl3)0.004g
硫酸镁(MgS04?7H20)0.1g
酵母膏1.0g
（或酵母粉0.8g）
pH6.8
A3、联合固氮菌培养基
D-葡萄糖酸钠（C6H11O7Na）5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4）0.4g
磷酸氢二钾（K2HPO4）0.1g
硫酸镁(MgS04?7H20)0.2g
氯化纳(NaCl)0.1g
氯化钙(CaCl2)0.02g
氯化铁(FeCl3)0.01g
硫酸镁(MgS04?7H20)0.1g
酵母膏1.0g（或酵母粉0.8g）
钼酸钠(Na2Mo04)0.002g
pH6.8~7.0
A4、马丁培养基（测霉菌数）
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g
硫酸镁(MgS04?7H20)0.5g
葡萄糖（C6H12O6?H20）10.0g
蛋白胨5.0g
1%孟加拉红水溶液3.3mL
[四氯四碘荧光素（C20H4Cl4I4O5）]
每升培养基中加入0.1g氯霉素，一起灭菌。
注：以上各培养基需蒸馏水1000mL，琼脂18~20g。
附录B
（标准的附录）
染色剂和染色方法
B1荚膜染色法
B1.1染色剂
石碳酸复红染色液
甲液：碱性复红(Basicfuchsin)(C20H20ClN3)0.3g
95%酒精10.0mL
乙液：石碳酸（C6H5OH）5.0g
蒸馏水95.0mL
a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。
b）将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。
c）将甲液和乙液混合摇匀，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释5~10倍使用。稀释液容易变质失效，一次不宜多配。
B1.2染色方法
B1.2.1取少量培养菌液涂于载玻片水滴中，涂成薄层。
B1.2.2自然干燥或稍加热。
B1.2.3在石碳酸复红染1min后，水洗，干后镜检。
B1.3染色结果
菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为荚膜。
B2芽胞染色法
B2.1染色剂
B2.1.15%孔雀绿
孔雀绿（C23H25ClN2）5.0g
蒸馏水100mL
B2.1.20.05%碱性复红
碱性复红(Basicfuchsin)(C20H20ClN3)0.5g
95%酒精100mL
B2.2染色方法
B2.2.1制片
B2.2.2加孔雀绿染液3~5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加染液，维持涂片处不干，染色约5~10min。
B2.2.3自来水冲洗30s。
B2.2.4用0.05%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若0.05%碱性复红浓度太高，可根据具体情况适当稀释）。
B2.3染色结果
芽胞绿色，菌体红色。
B3革兰氏染色法
B3.1染色剂
B3.1.1结晶紫染色液
甲液：结晶紫2g
乙醇(95%)20mL
乙液：草酸镀0.8g
蒸馏水80mL
甲、乙液相混合，静置48h后使用。
B3.1.2卢哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片1.0g
碘化钾(KI)2.0g
蒸馏水300mL
先用少量(3~5mL)蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。
B3.1.3脱色液(95%的乙醇)
B3.1.4复染液(0.5%的番红水溶液)
取2.5g番红，溶于l00mL无水酒精中。取番红酒精溶液20mL，加入80mL蒸馏水，即成0.5%的番红水溶液。
B3.2染色方法
B3.2.1制片
B3.2.2滴加结晶紫液，覆盖1min。
B3.2.3用水冲净结晶紫液。
B3.2.4滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min。
B3.2.5用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。
B3.2.6加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。
B3.2.7番红染色液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。
B3.3染色结果
革兰氏正反应菌体呈紫色，负反应菌体呈红色。
B4鞭毛染色
B4.1染色剂
甲液：单宁酸（C76H52O46）5.0g
氯化铁（FeCl3）1.5g
15%甲醛（HCHO）2.0mL
1%氢氧化钠（NaOH）1.0mL
蒸馏水100mL
乙液：硝酸银（AgNO3）2g
蒸馏水100mL
待硝酸银溶解后，取出10mL备用，其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。
B4.2染色方法
B4.2.1涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。
B4.2.2涂片干燥后，滴加甲液3~5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30~60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒汽而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。
B4.3染色结果
菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
京公网安备 11010202007233号
