饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法标准 -行业标准--中国农资供销网

饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法标准

时间：2009-11-11 15:36:03来源：[标签:出处]作者：刘玉

　　标准类别：GB-国家标准，关键词：饲料维生素D3测定高效液相色谱法。标准号：GB/T17818-1999，标准名称：饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法。标准分类：农业饲料标准。
1 范围
本标准规定了饲料中维生素D3的测定一一高效液相色谱法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生素预混料中维生素D3的测定。测量范围为每千克样品中含维生素D3（胆钙化醇）的量在500IU以上。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法
3 方法原理
用碱溶液皂化试验样品，乙醚提取未皂化的化合物，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色谱净化柱中除去干扰物，收集含维生素D3淋洗液馏分，蒸发至干，溶解于正己烷中，注入高效液相色谱分析柱，用紫外检测器在264nm处测定，通过外标法计算维生素D3的含量。
当样品中维生素D3标示量超过每千克10000IU时，可省去高效液相色谱净化柱，试验溶液直接注入色谱分析柱分析。
4 试剂和材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682用水的规定。
4.1 无水乙醚：无过氧化物。
4.1.1过氧化物检查方法；用 5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。若加0.5%淀粉指示液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
4.1.2去除过氧化物的方法：乙醚用 5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇洗涤两次，重蒸，弃去首尾 5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
4.2 乙醇。
4.3 正己烷：重蒸馏（或光谱纯）。
4.4 1，4-二氧六环。
4.5 甲醇：优级纯。
4.6 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）。
4.7 无水硫酸钠。
4.8 氢氧化钾溶液500g/L。
4.9 抗坏血酸乙醇溶液5g/L：取0.5g抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的蒸馏水中，用乙醇稀释至100mL，临用前配制。
4.10 氯化钠溶液100g/L。
4.11 维生素D3标准溶液
4.11.1维生素D3标准贮备液：准确称取50.0mg维生素D3（胆钙化醇）USP结晶纯品，于 50mL棕色容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，4℃保存。该贮备液的浓度为每毫升含 1mg维生素D3。
4.11.2维生素D3标准工作液：准确吸取维生素D3标准贮备液（4.11.1），用正己烷按 1∶100比例稀释，该标准溶液浓度为每毫升含10μg（400IU）维生素D3。
4.12 酚酞指示剂乙醇溶液10g/L。
4.13 氮气99.9%。
5 仪器、设备
5.1 实验室常用设备。
5.2 圆底烧瓶，带回流冷凝器。
5.3 恒温水浴或电热套。
5.4 旋转蒸发器。
5.5 超纯水器（或全磨口玻璃蒸馏器）。
5.6 高效液相色谱仪（两套），带紫外检测器。
6 试样的制备
选取有代表性的饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
7 分析步骤
7.1 试验溶液的制备
7.1.1皂化
称取试样，配合饲料10-20g，浓缩饲料10g，精确至0.001g。维生素预混料或复合预混料1-5g，精确至0.0001g。置入250mL。圆底烧瓶中，加50-60mL抗坏血酸乙醇溶液（4.9），使试样完全分散、浸湿，加10mL氢氧化钾溶液（4.8），混合均匀。置于沸水浴上回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL-乙醇、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃ 。
7.1.2提取
定量转移全部皂化液于盛有100mL乙醚（4.1）的500mL分液漏斗中，用30-50mL。蒸馏水分2-3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖，放气，随后混合，激烈振荡2min，静置分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100，60mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用氯化钠溶液（4.10）100mL洗涤一次，再用蒸馏水每次100mL洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠（4.7）脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mgBHT（4.6）使之溶解，用乙醚定容至刻度（Vex）。以上操作均在避光通风柜内进行。
7.1.3浓缩
从乙醚提取液（Vex）中分取一定体积（Vri）（依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量），置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度50℃的条件下蒸发至干，或用氮气吹干。残渣用正己烷（4.3）溶解（需净化时用甲醇溶解，按7.1.4进行），并稀释至10mL（Ven）使其获得的溶液中每毫升含维生素D32-10μg（80-400IU），离心或通过0.45μm过滤膜过滤，收集清液移入2mL小试管，用于高效液相色谱分析柱分析。
7.1.4使用高效液相色谱净化柱提取
用5mL甲醇（4.5）溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱中注射0.5mL甲醇溶液（按7.2.1所述色谱条件，以维生素D3标准甲醇溶液流出时间）收集含维生素D3的馏分于50mL小容量瓶中，蒸发至干（或用氮气吹干），溶解于正己烷中。
所测样品的维生素D3标示量在每千克超过10000IU范围时，可以不使用高效液相色谱净化柱，直接用分析柱分析。
7.2 测定
7.2.1高效液相色谱净化条件
柱和固定相：LichrosorbRP-8，粒度 10μm，25cm×10mm（内径）。
移动相：甲醇水（90 10）。
流速：2 0mL/min。
温度：室温。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
7.2.2高效液相色谱分析条件
7.2.2.1正相色谱
柱长：25cm、内径4mm不锈钢柱。
固定相：硅胶 Lichrosorbsi60，粒度5μm。
移动相：正己烷 1，4-二氧六环（93 7），恒量流动。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
保留时间：14.88min。
7.2.2.2反相色谱
柱长：12.5cm，内径4mm不锈钢柱。
固定相：ODS（或 C18），粒度5μm。
移动相：甲醇水（95 5），恒量流动。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
保留时间：6.88min。
7.2.3定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（AUFS），为准确测量按要求对分析柱进行系统适应性试验，使维生素D3与维生素D3原或其他峰之间有较好分离度，其R≥1.0。向色谱柱注入相应的维生素D3标准工作液（4.11.2Vst）和试验溶液（7.1.3Vi），得到色谱峰面积的响应值（ Pst、Pi），用外标法定量测定。
8 结果的计算与表述
8 1 计算公式：结果按式（1）计算：
Pi×Vex×Ven×ρi×Vst×1.25
ωD= ………………………（1）
Pst×m×Vri×Vi×fi
式中：ωD———每克或每千克样品中含维生素D3的量，IU；
m———样品质量，g；
Vex———提取液的总体积，mL；
Vri———从乙醚提取液（Vex）中分取的溶液体积，mL；
Ven———试验溶液最终体积，mL；
ρi———标准溶液浓度，%g/mL；
Vst———维生素 D3标准溶液进样体积，μL；
Vi———一从试验溶液中分取的进样体积，μL；
Pst———与标准溶液进样体积（Vst）相应的峰面积响应值；
Pi———与从试验溶液中分取的进样体积（Vi）相应的峰面积响应值；
fi———转换系数，1国际单位（1U）维生素D3相当于0.025μg胆钙化醇；
1.25———为回流皂化时生成维生素D原的校正因子。
注：标准维生素D3结晶纯品与试样同样皂化处理后，所得标准溶液注入高效液相色谱分析柱以维生素D3峰面积计算时可不乘1.25。

8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。
9 允许差
同一分析者对同一试样同时两次测定（或重复测定）所得结果相对偏差：
每千克试样中含维生素 D3的量，IU 允计相对偏差，%
1.00×M-1.00×Y ±20
>1.00×Y-1.00×T ±15
>1.00×T ±10
注：M=10的3次方；Y=10的5次方；T=10的6次方。