维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法标准 -行业标准--中国农资供销网

维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法标准

时间：2009-11-11 15:36:04来源：[标签:出处]作者：成龙

　　标准类别：GB-国家标准，关键词：维生素B12测定液相色谱法，标准号：GB/T17819-1999，标准名称：维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法，标准分类：农业饲料标准。
1 范围
本标准规定了用高效液相色谱法测定维生素预混料中维生素B12的方法。
本标准适用于维生素预混料、维生素B12预混制剂中维生素B12的测定。检测范围为每千克样品中维生素B12含量大于0.25mg。
2 方法原理
试样中维生素B12用水提取，经高效液相色谱反相柱分离，其峰面积与维生素B12的含量成正比。
3 试剂和材料
本标准所用试剂除特殊注明外，均为优级纯，水为去离子水。
3.1 乙腈：色谱纯。
3.2 正磷酸溶液。
3.3 25%乙醇溶液。
3.4 维生素B12标准溶液。
3.4.1维生素B12标准贮备溶液：准确称取0.1000g维生素B12纯品（符合USP），溶解
于100mL乙醇溶液（3.3）中，并稀释定容至刻度，摇匀。该标准贮备液每毫升含维生素 B121mg。
3.4.2维生素B12标准工作液：准确吸取维生素B12标准贮备液（3.4.1）1mL于50mL容量瓶中，用移动相稀释定容刻度，摇匀。该标准工作液 1mL含维生素B122μg。
4 仪器、设备
4.1 实验室常用设备。
4.2 超声波水浴。
4.3 高效液相色谱仪，带自动进样器，紫外可调波长检测器。
4.4 超纯水装置。
4.5 离心机：3000r/min。
5 试样制备
取具有代表性样品至少500g，用四分法缩分至100g，粉碎，全部过0.28mm孔筛，混匀，装入样品瓶内密闭，避光低温保存备用。
6 分析步骤
6.1 提取
6.1.1维生素预混料中维生素B12的提取
称取试样2-3g（精确至±0.0001g），置于 100mL棕色容量瓶中，加约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取15min，取出，用去离子水定容至刻度，混匀，过滤，滤液过0.45μm滤膜，供高效液相色谱仪分析。
6.1.2 维生素B12制剂（1%-2%）的提取
称取试样1g（精确至±0.0001g）于100mL棕色容量瓶中，加入约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取10min，取出用去离子水定容过滤。精确吸取1.00mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，该液通过045μm滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。
6.2 测定步骤
6.2.1色谱条件
柱子：μ-BondpakNH2，粒度5μm，3.9mm×300mm。
柱温：30℃ 。
流动相：3%正磷酸水溶液260mL与700mL乙腈混合，超声脱气。
流速：1.7mL/min。
检测波长：361nm。
6.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，用两次以上相应标准工作液，对系统进行校正。
将通过0.45μm滤膜的样液（6.1.1）依次分装于自动进样小瓶中，依外标法上液相色谱仪测定。
6.2.3也可采用反相离子对高效液相色谱测定维生素B12的方法（见附录A）
7 测定结果的计算
测定结果按式（1）计算：
Pi×V×ρi×Vst
ωi= ………………………………（1）
Pst×m× Vi
式中：ωi———每千克样品中维生素 B12的含量，mg；
m———试样质量，g；
Vi———试样溶液进样体积，μL；
Pi———试样溶液峰面积值；
V————试样稀释的体积，mL；
ρi———标准溶液浓度，μg/mL/；
Vst———标准溶液进样体积，μL；
Pst———标准溶液峰面积平均值。
每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。结果表示到每千克样品中维生素B120.01mg。
8 允许差
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差应不大于15%。

附录A
（标准的附录）
反相离子对高效液相色谱
测定预混料中维生素B12
A1 原理
试样中维生素 B12经水提取后，注入反相色谱柱上，由于输入了有机的反相离子对四丁基磷酸铵（PICA）和己烷磺酸钠（PIC—B6）溶液，维生素 B12的阳离子与移动相中阴离子形成离子偶化合物，在移动过程中与固定相分开达到分离。
A2 试剂和材料
A2.1 甲醇（优级纯）。
A2.2 磷酸。
A2.3 四丁基磷酸铵（PICA）。
A2.4 己烷磺酸钠（PIC—B6）。
A3 测定色谱条件
柱子：150mm×4.0mm（内径）不锈钢柱。
固定相：%-BondpakC18（ODS）粒度 5%m。
移动相：甲醇 -水（250 750）约980mL，加入PICA、PICB6（各一小瓶）20mL，用上述 25%甲醇水定容至1L，混匀，用磷酸调节pH3。
流速：1mL/min。
柱温：室温。
检测器：紫外检测器，使用波长365nm。
进样量：20%L。
保留时间：约7.0min。
A4 其他各项与正文相同