饲料氨基酸测定标准 -行业标准--中国农资供销网

饲料氨基酸测定标准

时间：2009-11-11 15:36:04来源：[标签:出处]作者：锡山

　　标准类别：GB-国家标准，关键词：饲料氨基酸测定，标准号：GB/T18246-2000，标准名称：饲料中氨基酸的测定，标准分类：农业饲料标准。
1 范围
本标准规定了饲料中氨基酸的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、单一饲料和预混料中氨基酸总量和添加游离氨基酸的测定。
酸、碱水解法适于含动、植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸总量的测定。酸水解法不能测定色氨酸，其中常规水解法适于测定除含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸等）以外的蛋白水解氨基酸；氧化水解法在以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，适于测定除酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸，在以氢溴酸为终止剂时，适于测定除酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸以外的蛋白水解氨基酸。碱水解法只适于色氨酸的测定。
酸提取法适于配合饲料、预混料和浓缩饲料中添加氨基酸，主要是赖氨酸、蛋氨酸含量的测定，也可用于苏氨酸等其他添加（游离）氨基酸含量的测定。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T6432—1994 饲料中粗蛋白测定方法（eqvISO5983：1979）
GB/T6433—1994 饲料粗脂肪测定方法（eqvISO5983：1979）
GB/T15399—1994 饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法
3 方法原理
3.1 酸水解法
常规（直接）水解法是使饲料蛋白在110 、 c（HCl） =6mol/L盐酸作用下，水解成单一氨基酸，再经离子交换色谱法分离并以茚三酮做柱后衍生测定。水解中，色氨酸全部破坏，不能测量。胱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等）用过甲酸氧化，然后进行酸解，再经离子交换色谱分离、测定（详见GB/T15399）。水解中色氨酸破坏，不能测定。酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，被氧化，不能测准。酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸作终止剂时被氧化，不能测准。
3.2 碱水解法
饲料蛋白在110 、碱的作用下水解，水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱（见附录A）分离、测定。
3.3 酸提取法
饲料中添加的氨基酸以稀盐酸提取，再经离子交换色谱分离、测定。
4 试剂和材料
除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水，电导率小于1S/m。
4.1 酸水解法
4.1.1常规水解
4.1.1.1酸解剂———盐酸溶液， c（HCl） =6mol/L：将优级纯盐酸与水等体积混合。
4.1.1.2液氮或干冰 -乙醇（丙酮）。
4.1.1.3稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH2 2， c（Na ） =0 .mol/L：称取柠檬酸三钠 19.6g，用水溶解后加入优级纯盐酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，加水定容至1000mL，摇匀，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤，备用。
4.1.1.4不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。
4.1.1.5茚三酮溶液：按仪器说明书配制。
4.1.1.6氨基酸混合标准储备液：含 -天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸，各组分浓度 c（氨基酸） =2.50（或2.00）L-mol/mL。
4.1.1. 混合氨基酸标准工作液：吸取一定量的氨基酸混合标准储备液（4.1.16）置于
50mL容量瓶中，以稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.1.13）定容，混匀，使各氨基酸组分浓度c（氨基酸）=100nmol/mL。
4.1.2氧化水解
按 GB/T15399—1994中7.1氧化水解步骤操作。
4.2 碱水解法
4.2.1 碱解剂———氢氧化锂溶液 c（LiOH）=4mol/L：称取一水合氢氧化锂167.8g，
用水溶解并稀释至1000mL，使用前取适量超声或通氮脱气。
4.2.2液氮或干冰—乙醇（丙酮）。
4.2.3盐酸溶液，c（HCl）=6mol/L：配制方法同 4.1.1.1。
4.2.4稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH4.3，c（Na ） =0.2mol/L：称取柠檬酸三钠14.71g、氯化钠2.92g和柠檬酸10.50g，溶于500mL水，加入硫二甘醇5mL和辛酸0.1mL，最后定容至1000mL。
4.2.5不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液与茚三酮溶液：按仪器说明书配制。
4.2.6 L-色氨酸标准储备液：准确称取层析纯 L-色氨酸102.0mg，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，定量地转移至100mL容量瓶中，加水至刻度。c（色氨酸） =5.00μmolmL。
4.2.7氨基酸混合标准储备液：同4.1.1.6。
4.2.8混合氨基酸标准工作液：准确吸取2.00mLL-色氨酸标准储备液和适量的氨基酸混合标准储备液，置于50mL容量瓶中并用pH4.3稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.2.4）定容。该液色氨酸浓度为200nmol/mL而其他氨基酸浓度为100nmol/mL。
4.3 酸提取法
4.3.1提取剂———盐酸溶液，c（HCl） =0.1mol/L：取8.3mL优级纯盐酸，用水定容
至1000mL，混匀。
4.3.2不同 pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。
4.3.3茚三酮溶液：按仪器说明书配制。
4.3.4蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液：于三只100mL烧杯中，分别称取蛋氨酸
93.3mg、赖氨酸盐酸盐114.2mg和苏氨酸74.4mg，加水约50mL和数滴盐酸溶解，定量地转移至各自的250mL容量瓶中，并用水定容。该液各氨基酸浓度（氨基酸） =2.50μmol/mL。
4.3.5混合氨基酸标准工作液：分别吸取蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液各1.00
mL于同一25mL容量瓶中，用水稀释至刻度。该液各氨基酸的浓度c（氨基酸）=100nmol/mL。
5 仪器、设备
5.1 实验室用样品粉碎机。
5.2 样品筛：孔径0.25mm。
5.3 分析天平：感量0.0001g。
5.4 真空泵与真空规。
5.5 喷灯或熔焊机。
5.6 恒温箱或水解炉。
5.7 旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度±1C，真空度可低至3.3×103Pa（25mm汞柱）。
5.8 氨基酸自动分析仪：茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪，要求各氨基酸的分辨率大于90%。
6 样品
取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g左右，粉碎并过0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
酸水解样品按GB/T6432测定蛋白质含量。
碱水解样品，按 GB/T6433测定粗脂肪含量。对于粗脂肪含量大于、等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装入密闭容器中备用。而对粗脂肪小于5%的样品，则可直接秤用未脱脂样品。
7 分析步骤
7.1 样品前处理
7 1 1 酸水解法
7.1.1.1常规水解法：称取含蛋白7.5-25mg的试样（约50-100mg，准确至0.1mg）于20mL安瓿中，加10.00mL酸解剂（4.1.1.1），置液氮或干冰（丙酮）中冷冻，然后，抽真空至 7Pa（≤5×10的负2次方mm汞柱）后封口。将水解管放在（110±1）恒温干燥箱中，水解 22-24h。冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中、60℃，抽真空，蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1-2次。加入3-5mLpH2 2稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.1.1.3），使样液中氨基酸浓度达50-250nmol/mL，摇匀，过滤或离心，取上清液上机测定。
7.1.1.2氧化水解法：按 GB/T15399—1994中7.1规定操作。
7.1.2碱水解法：称取50-100mg的饲料试样（准确至0.1mg），置于聚四氟乙烯衬管中，加1.50mL碱解剂（4.2.1），于液氮或干冰乙醇（丙酮）中（4.2.2）冷冻，而后将衬管插入水解玻管，抽真空至 7Pa（≤5 10-2mm汞柱），或充氮（至少5min），封管。然后，将水解管放入（110±1）℃恒温干燥箱，水解20h。取出水解管，冷至室温，开管，用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.2.4）将水解液定量地转移到10mL或25mL容量瓶中，加入盐酸溶液（4.2.3）约1.00mL中和，并用上述缓冲液定容。离心或用 0.45μm滤膜过滤后，取清液贮于冰箱中，供上机测定使用。
7.1.3酸提取法：称取1-2g饲料试样（蛋氨酸含量≤4mg，赖氨酸可略高），加0.1mol/L盐酸提取剂（4.3.1）30mL，搅拌提取15min，沉放片刻，将上清液过滤到100mL容量瓶中，残渣加水25mL，搅拌3min，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣，并定容。摇匀，清液供上机测定。若试样提取过程中，过滤太慢，也可离心10min（4000r/min）。测定赖氨酸时，预混料和浓缩饲料基质会有较大干扰，应针对待测试样同时做添加回收率实验，以校准测定结果。
7.2 测定
用相应的混合氨基酸标准工作液（如4.1.1.7、4.2.8或4.3.5等）按仪器说明书，调整仪器操作参数和（或）洗脱用柠檬酸钠缓冲液的 pH，使各氨基酸分辨率≥85%，注入制备好的试样水解液和相应的氨基酸混合标准工作液，进行分析测定。酸解液每10个单样为一组，碱解液和酸提取液每6个单样为一组，组间插入混合氨基酸标准工作液进行校准。
8 分析结果的表述
分别用式（1）和式（2），计算氨基酸在试样中的质量百分比：

A1i
ω1i（%） = ×10的6次方×D× 100…………………………（1）
m
A2
ω2（%）= ×（1-F）×10的6次方×D×100…………………（2）
m
式中：ω1i———用未脱脂试样测定的某氨基酸的含量，%；
ω2———用脱脂试样测定的色氨基酸的含量，%；
A1i———每毫升上机水解液中氨基酸的含量，ng；
A2———每毫升上机液中色氨酸的含量，ng；
m———试样质量，mg；
D———试样稀释倍数；
F———样品中的脂肪含量，%。
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。
附录 A
（标准的附录）
色氨酸测定反相高效液相色谱（RP-HPLC）法
除测定时将氨基酸分析仪更换为反相液相色谱仪、相应的洗脱用柠檬酸钠缓冲液更换为下述流动相，以及用下述具体的仪器测定条件外，其试剂、设备、样品前处理以及结果计算、表述和允许差等均同正文。
A1 液相色谱仪
具适当内径、长度和柱材粒度的C18柱（如25cm×4.6mm内径的%-BondapakC18柱）、紫外（UV）或荧光检测器。
A2 流动相，乙酸钠缓冲液〔c（Na )=0.0085mol/L的乙酸钠溶液用乙酸调节pH至4.0，用0.45μm的滤膜过滤）甲醇 =95 5。
A3 测定
条件：柱温：室温；
流动相流速：1.5mL/min；
检测：紫外检测波长：280nm；
荧光检测：激发波长：283nm；
发射波长：343nm；
进样量：15μL。
先从混合氨基酸标准工作液开始分析，每 6个水解液为一组，组间插入氨基酸标准工作液（4.2.8）进行校准。